免疫检验质控 第十九章 临床免疫检验的质量保证.pdf

第十九章临床免疫检验的质量保证免疫检验自动化仪器 复习考查题 1、化学发光免疫分析仪的检测原理 2、酶联发光免疫分析仪的检测原理 3、电化学发光免疫分析仪的检测原理答案 1、直接化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体萼强原I哒救生微粒发审楫整整如二种自劲化冬 直较（叶咤酯林他）发光只需加入氧让荆和pH?需要酶催化。液，不 2、酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物 玛普髓:螂懒鬻O,速博光信号的窜型 过氧化物酶（HRP）和4性磷酸酶（ALP）,常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4MUP 等。3、电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术、生物素内容第一节 第二节 第三节分析前质量控制 分析中质量控制 分析前质量控制质量保证 是临床实验室为证明提供给患者临床诊 疗或临床实验研究数据的有效性而采取的一系列措 施，涵盖了实验室内进行检测前后的所有活动。临床免疫学检验既有手工操作、定性或半定量的试 验，也有以各种新技术、新方法为基础的自动化仪 器定量试验。由于它们流程复杂，影响结果的因素 很多，包括从样本采集前患者准备到检验报告的审 核、发送以及与临床进行沟通等流程的各个方面。通常，将这个完整的检验流程分为分析前、分析中、分析后三个过程，对这三个过程实行质量控制的侧 重点各不相同。第一节分析前质量控制分析前是指从临床医生开出医嘱起，按时间顺序 的步骤，包括提出检验要求、患者准备、原始标 本采集、运送到实验室并在实验室内传送，至分 析检验程序启动前的过程。分析前质量管理是决 定检验结果正确、可靠的前提，涉及包括检验人 员、临床医师、护士、护工以及受检者本人等各 部门，容何环节的疏漏或不规范均可导致检验结 果的误差。一、检验项目的申请检验申请是检验流程的重要环节，其信息规范性 与宛整性应辰续检验通建士余重凄申请有纸质 和电子形式或两者同时徒用哮方式。（一）申请单格式和填写按照国家相关规定,检验申请单基本信息应至少包括：受检者唯一性标识，如姓名、性别、年龄、科 别、病房、门诊号/住院号等；临床诊断或疑似诊 断；标本类型；检验项目；送检日期（年、月、日）及标本采集时间与标本接受时间；申请者唯一标识（医师签字）；收费/记账以及检验号等。检验申 请单的填写内容要规范、完整，以保证为后续检验 流程提供必需的信息。（二）检验项目的申请原则临床医生可根据就诊者的疾病诊疗需要而选择合适 的检验项目，检验人员也应根据检验项目的检测性 能，与临床医生定期沟通，以保证检验项目的有效 性、及时性、经济性。二、患者准备 医护人员费茉采集人员、检验技术人员应了解采 集前患者的状态要求和影响结果的非疾病性因素，并将相关的要求和注意事项通过合适的途径告知患 者，以获食建直的配金，保证所采集标本能客观真 实反映当箭的疾病状态。三、标本的采集、传送与保存（一）标本的采集 对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要 注意喙集心间及体位对测定结果里生的整则7如可 的松茬早晨4:006:00之间，会有一峰值出现；生阵发性方式释放；当从卧位变为站立位时，血清 搀毓翳擘1黑应根佥测。口用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种 蛋白等检测的血清标本的收集则无时间和体位等的影 响。采样量应根据检测的需要而定，首先必须满足检 测需要，但不过分采集。标本应采集在密闭的容器中,以方便后续的传送。每个标本应有唯一性的标志，保 证标本与检验申请单相对应。很多临床免疫检测项目 不能当天完成，实验室经常通过“分单”的方式将标 本和尚未完成的检测项目从现有申请单中分出，在这 种情况下，一定要保证分单标本有唯一性的标志，并 保证能溯源到原始标本。（二）标本的传送及保存标本自采集后到送达检验部门的过程即标本 的传送。标本传送过程中应保证标本的密闭、防震、防漏、防污染。运送过程尽可能快捷，特殊标本如胰岛素、C肽等测定时，应尽量置 冰盒中送检。随着辅助技术的发展，为保证标 本传送的可靠、及时，有些实验室选择安装了 气动（真空）或履带式标本智能化传送系统，可方便地实现标本在病区、门诊、急诊和实验 室间的传送。四、影响分析前质量的因素由于免疫检测的被测量对象通常在体内的含量很低，因此，影响这些对象检测结果的因素也 很多。此外，由于分析前质量管理的特点，如 很多因素是实验室不可控制的，需要临床医生 护士的参与和配合，有些质量缺陷不能被及时 发现，即便发现问题，有些责任也无法落实到 人。因此，建立完整的分析前质量管理体系是 确保分析前质量的有力保证。第二节分析中的质量控制分析中阶段是指从标本前处理到标本检测完成,形成报告结果的过程，包括标本前处理、标本 的检测，还包括检测体系的建立、人员培训、检测系统的选择和性能确认、室内质量控制和室间质量控制、实验室间比对等内容，是决定检验结果正确、可靠的关键,也是临床免疫检测质量保证的核心。工工作人员培训临床免疫检验的项目广泛，检测技术众多，既包括手工操作，又包括自动化仪器操作，要求 工作人员具有一定的技术知识和经验。特别是采用手工操作的检测项目，不同的工作人员的操作及结果判断的主观性往往导致检测结果的差异。因此，为了使工作人员具备进行临床免疫检验的相关技能，根据实际工作的需要，建立定期培训计划，保证工作人员的技能满足临 床免疫检验的需要。二、检测系统性能的确认检测系统定义是指完成一个检验项目的测定所 涉及的仪器、试剂、校准品、耗材等的组合。临床免疫检验中使用的检测系统的好坏，将直接影响检测结果的质量。在将确定的检测系统应用 到临床前，需要通过评估来判断该检测系统的性能是否符合厂家申明，是否符合临床要求。临床 免疫检测系统性能的评估内容至少包括精密度(批内、批间)、准确度、分析测量范围、临床可报告范围、参考区间验证等内容。必要时，针 对某些特殊项目，如促甲状腺激素(TSH)、肌钙 蛋白l(Tnl)等，还需要确定检测系统的分析灵敏度。三、标准操作规程（standard operation procedure.SOP）的建立在免疫测定中，试剂准备、加样、温育、洗板、显 色（或测定信号激发）和测定等每一步骤均可能对测 定结果产生较大影响。确保检测结果可靠性首先考虑 的是改善测定精密度，因此必须着重在最不精密的步 骤上。为此，需要将每个操作步骤标准化并形成SOP。所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按 相应的SOP进行操作。根据卫生部行业标准，SOP内 容应包括实验原理或检验目的、标本种类及收集要求、操作步骤（试剂准备、加样、孵育时间、孵育方式、显色时间等）、计算方法、参考范围、临床意义、操 作注意事项、参考资料等内容。对于仪器的标准化操 作程序也有相应的要求。四、标准曲线的校准与标准品值的溯源（一）标准曲线的校准所谓标准曲线的校准，是指将标定了分析物浓度的定此,标品在检测系统上检测并获得分析物浓度高低与检测设 备信号强弱之间关系的步骤。进行校准的目的是为了实;t迤覆可匆腐曩检测设 G茬校鞋的概念。期筐检物质的患萋串IL WT 备而言的，定性和半定量检测不在下列情况时，需要对标准曲线进行校正：标准曲 线过期；在新批号试剂使用前；仪器相关部位经过 较大维修、配件更换或缓冲液等试剂的升级。值得一提 的是，室内质量控制结果超出范围时，并不需要在第一 攀麟罐襄端爨膜燃髓键1疆熟墓(二)标准品值的溯源标准品的特性应该清楚明确，理想的标准品应该是纯品，但如特 定分析物质具有同种型不均一性，则相应的标准品也应具备这种 特点。这种要求通常难以满足，因为在纯化过程中，使用生化方 法去除杂质会引起特定物质同种型的少量丢失。而使用免疫亲和 层析纯化，则由于洗涤过程常需在低pH变性条件下进行，有可能 会引起某些蛋白的不可逆修饰。基因重组蛋白，一是表达产物仍 需纯化和糖基化，二是糖基化可能与天然蛋白有所不同。目前，真正具有国际参考物质的免疫测定项目并不多，国家临床实验室 标准化委员会(National Committee of Clinical Laboratory Standardisation,NCCLS)以及美国和加拿大临床化学协会(American Societies for Clinical Chemistry and Canadian Societies for ClinicalChemistry and Canadian9 AACC和 CSCC)等正致力于免疫测定的标准化工作，这些组织也制备一些 标准品。理想的标准品应具备的特征1.标准品的基质通常为含蛋白的缓冲溶液，对测 定结果无明显影响。2.对标准品的浓度一般无特殊要求，在方法的 测定范围内即可。3.保持稳定性，在一定时间内，在规定的保存条 件下应有良好的稳定性。4.无己知的传染危险性，对已知的经血液传播的 病原体如HIV、HCV和HBV等必须作灭活处理。5.靶值或预期结果已定。119-1适肝各种球贩的标准品的T腰求林娜雌.端滩拗郁.桶小，硼口蒯10-20|f.1.眦物肝德懒般棚、舲螂（蜥i帼诚敏怫纷除卜益）、瞬趣枷德储Ml力禄假郴松怖钏瞰中如胭多W心怫厥嫩州级树毗对帔帆，小她、肌M自1,701卜队脚械/蹄泗1，修雌川源1科2对肝不同类型免疫斐要求低分子量化的（麴 血清蛋且 鼠利利幡标志物）化学纯（99%）纯度 熟的蛋白趟方法氨基酸分析（物解度）称重（质量浓度）比腌早的标准进行 免蒯定（IU）生娜淀（IU）国询织的一 致性结果 比对纯蛋白进 行免疫测定（质量浓度）称重（物质和质量辘）光电比鳏定应选用制造商提供了溯源性的产品,通过校准品可为保证临床免疫检测结果的可比性，针对已建立国际标准 的检测项目，应要求所选用检测系统的制造商提供溯源性 幻牛&9亚普逋速遂瘠逊系统的检测结果 一逐级溯源到国际参考物质(international r_(international reference material)。通常国际参考物质为一级标准品，国家标准 品则为二级标准，可溯源至一级标准，二级标准可用来维.品则通过与二级标准的比对而来，为通口口。从一级标准的值传递到最终试验所使用的校准物的过程通 常由几个校准步骤组成，包括标准品和测定方法、缓冲液 及其基质、稀释的控制、最终结果的统计学评价和质量控 融氮/凤也廿折塑如典遭缉生,肱邀耆或与载体蛋白 结合的低分子量激素等其校准过程有所不同。标准品值的溯源模式图见图191。校准品值溯源模式图五、定量免疫测定的室内质量控制室内质量控制（Internal QualityControl,IQC）由实验室人员采取一定的方法和步 骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监 测和控制本室常规工作的精密度，提高本室常规工 作中批内、批间样本检验的一致性。并确定当批的 测定结果是否可靠，可否发出检验报告。免疫定量测定IQC的方法，包括（一）、（二卜（三卜（四卜（五卜（六）内容略。六、半定量及定性免疫测定的IQC半定量及定性免疫检验方法较多，主要有沉淀试验、凝集 试验、荧光免疫试验、化学发光免疫试验和酶免疫试验等,测定结果的判断为反应性或非反应性、阴性或阳性。此类 测定的质量控制要点是测定下限，因此应选择靶抗原或抗 体浓度接近试剂盒或方法的测定下限的质量控制品进行室 内质量控制，并与临床标本的测定同时进行，以判断检测 方法的有效性。如自身抗体检测的荧光免疫试验，每次测 定都应至少带一人已知的弱阳性对照，从而有助于判断临 床标本的检测结果是否有效。此外，根据所用方法的特点,如酶免疫试验中双抗夹心模式中的一步法，还须用高浓度 质量控制品进行质量控制，以防止前带现象的发生。至于 阴性质量控制，对于定性免疫检验来说，也是必需的。半定量及定性的免疫测定室内质量控制结果，由于结果判读、记录容易,用质量控制图进行判断。般不需要像定量免疫测定项目一样使七、室间质量评价（External Quality Assessment,EQA）为客观地比较某一实验室的测定结果与靶值的差异,由外单位机构，采取一定的方法，连续、客观地评 价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验 室之间的结果具有可比性。是对实验室操作和实验 方法的回顾性评价。能力比对（proficiency testing,PT）将多个样 品定期送往实验室组的成员进行分析和/或鉴定，将 每一实验室的结果与同组内其他实验室的结果或目 标值比较，并将比较结果报告给参与的实验室。室间质量评价内容，包括（一）、（二卜（三）略八、实验室间比对和人员比对实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或 多个实验室对相同或类似检测物品（通常是新鲜 患者标本）进行检测。相对于室间质量评价，实验室间比对可弥补实验室因室间质量评价项目涵盖因素，或因成本问题不能参加的缺陷，也可消 除或减少室间质量控制品的基质效应，还可评估 实验室分析前的误差，特别适用于室间质量评价不包括的项目。通常用于与上级或同级医院实验室间的比对，以评估该检测项目结果的可靠性,判断依据同室间质量评价结果的评价依据。人员比对是指实验室为发现及纠正不同工作人员 从事相同检测项目而导致结果存在不可接受的偏 倚而采取的措施。由于不同的实验室人员可能从 事同一项目的检测，特别是对于手工检测项目，实验室必须定期对人员间进行比对，以评估该检 测项目结果的可靠性，判断依据同室间质量评价 结果的评价依据。九、实验室环境、设施及设备的控制处于良好运行状态的临床实验室，应有充分的空间、良好的照明和空调设备；实验室仪器设 备应保养良好；临床免疫检测项目检测过程中 涉及的关键设备，包括但不限于离心机、加样 器、温度计、孵育箱、酶标读数仪、各种全自 动检测设备等，均应由有资质的单位或授权者 进行定期校准，以保证使用中的有效性。第三节分析后质量控制分析后的质量控制是指对获得检验结果后的主要 过程进行质量控制，主要包括检验结果的审核和 器咨修验醯本的保存与处理及为患者和医护一、检验结果的审核和发放检验结果的审核是分析后质量控制中的关键环节,只有审核合格后的检验报告才能发送给临床。检 验报告的报告方式应符合规定，并被临床接受，检测项目名称及结果描述的应规范。具.是量者符测时求报急 由括式质患的检及要验危 者包格内据情次过就检，核应的室根病本通这的床 审容果的应者对可。成临 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作。分析后质量控制重点在于与临床医护建立定期的沟通机制。能影响临床免疫检测的很多因素常常不在实验室 的直接控制下，但实验室有责任为患者或临床 医生如何正确地使用实验室测定结果提供明确 的建议，并在适当的情况下，对测定结果做出解释。临床免疫检验实验室的质量保证是实验室的核心内容,要做好质量保证，必须要了解影响实验室测定质量的实验室过程的所有步骤，实验室测定过程中最薄弱的环节将直接影响整个实验室的检验质量。实验室只有 建立完整的质量保证体系，并严格实行，才能从根本 上保证临床免疫检测的质量符合临床的需要。现代的 免疫检验实验室已经进入到信息时代，建立实验室质 量管理的信息系统，将使实验室硬件和软件的管理变 得简单易行，并更容易与临床建立起有机的联系，从 而树立实验室质量管理的新理念。兀临床免疫检验质量保证章节 考查题 1、临床免疫检验质量保证的主要内容包括哪 几个？2、你认为临床免疫检验质量保证的主要内容 中主要与临床医生、护士或患者有关的是什么 环节？主要与检验人员相关的又是什么环节？3、在与检验人员主要相关的环节中你认为最 重要的是那几点？第七节 影响免疫实验结果的 标本因素一、标本的正确收集及处理 标本类型及采集容器要求 标本采集时间及患者准备要求 内源性干扰因素 外源性干扰因素标本类型及采集容器要求最常用的标本类型:血液（血清、血浆和全血）、唾液或尿液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器。建议采用真空采血管及蝶形针具，以免 直接接触血液。标本采集时间及患者准备影响因素 激素和治疗药物 感染性病原体抗原、抗体肿瘤标志物 特定蛋白后三者是主要的内源性干扰，犹应重视。三、内源性干扰因素有：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、冷凝集素、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等。影响：它们可引起免疫实验的假阳性或假阴性结果。较的望 更结言CH2类风湿因子干扰的排除 稀释标本 改变标记抗体 用变性IgG预先封闭标本中RF 测抗原,可先加入还原剂如2-筑基乙醇去除RF 使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体固相抗体和标记抗体的分子可因环境、PH等因素改变而发生变构，使其Fc段的补体Clq结合位点被暴露出 来。这时如存在补体，它就成为一个中介物将固相抗 体和标记抗体二者交联起来，从而出现假阳性结果。变构的固相抗体、标记抗体等也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结 果或结果偏低。补体干扰的排除 56 30min加热可使标本中补体Clq灭 活使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相 抗体异嗜性抗体的干扰天然的异嗜性抗体（IgG）可分为两类:可结合于小鼠、大鼠、马、牛和山羊IgG的Fab 区域可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳 性反应。使用特异的兔F(ab，”片段作为固相或标记抗体。在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig,封闭可能存在 的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。使用靶特异的非Ig亲和蛋白(Affibody)替代固相或标记抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄 球菌A蛋白(SPA)联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于 IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。抗鼠Ig抗体的干扰 抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定可 产生假阳性结果，排除：使用特异的抗体F（ab，）2片段作为固相或标记抗体。在标本或标本稀释液中加入过量的鼠1g,封闭可 能存在的抗鼠抗体。使用特异的鸡抗体IgG作为固相和标记抗体，因 鸡IgG东写人疣南抗体反应。自身抗体干扰自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在免疫 测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定。为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离O溶菌酶干扰溶菌酶有与等电点低的蛋白结合的特性。双抗体 夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和标 记的IgG（它们等电点为5）间形成桥接，从而导 致假阳性。去除溶菌酶或将其封闭，CM+离子和 卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。冷凝集素冷凝集素综合征是IqM抗体引起的自体免疫性疾病，又叫31。（:32。（:以上的温度，抗体与红细胞抗原发生完全可逆 的分解，症状迅速消失。本综合征可以是特发性的或继发 魏谶矗神常牌瞽藉1聘瘤或支原体属肺病例某女，42岁，冬天住院，抽血标本（EDTA抗凝）似 豆腐渣样，放37 C渣样消失，低温时复出现，雷诺氏症 状阳性（镜下WBC粘成团，手指上有青斑紫斑，放37。C 斑点马上消失，拿出1分钟复现斑块）。该类病人标本合血 时要放37。C下观察。其冷抗体阳性，WBC、RBC、Pt显 著下降。四、外源性干扰因素溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝 不全、反复冻融标本溶血影响血红蛋白类似过氧化物的活性，使反应显色 取材时注意避免标本出现严重溶血。排除：在接受标本时对溶血标本拒收，对难获得的标本或特殊情况在结果报告单上注明“溶血”提示医生。标本被细菌污染影响细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 等蛋白产生分解作用细菌的内源性酶如大肠杆菌的0-半乳糖甘酶本身会 对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。排除：尽量用新鲜标本并及时检测，不能及时做时低温保存。标本贮存时间过长影响标本在28下保存时间过长，IgG可聚合成 多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过 深、甚至造成假阳性。排除：血清标本如是以无菌操作分离，则可 以在28 c下保存一周，如为有菌操作，则 建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在一 70以下。标本凝固不全影响血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残田部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果 排除：血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂O冰冻保存标本避免反复冻融影响反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。排除：避免反复冻融标本。思考题1.与质量保证相关的定义有哪些，各自的含义是2.3.4.5.什么？定性免疫检验的质量控制要求是什么?室间质量评价的概念及意义。临床免疫学检测中常见的干扰因素有哪些?实验方法诊断效率评价的指标有哪些？各自的含义是什么?