叶绿素含量的测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二,.,叶绿素含量的测定,高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素,(,光合色素,),吸收的。叶绿体色素由叶绿素,a,、,叶绿素,b,、,胡萝卜素和叶黄素组成。,在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。,一,.,实验原理,叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度,(,也称为光密度,),，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。,叶绿素,a,、,b,在长波的最大吸收峰分别在,663nm,、,645nm,，据,Lamber,-Beer,定律，可得浓度,C,与光密度,D,间的关系式：,D,663,=82.04C,a,+9.27C,b,D,645,=16.75C,a,+45.6C,b,(,浓度单位：,g/mL,）,C,A,=12.72D,663,2.59D,645,C,B,=22.88D,645,4.68 D,663,C,T,=20.29D,645,+8.02D,663,(,浓度单位：,mg/L,）,二,.,试剂与材料,2.1,试剂：,丙酮、石英砂、碳酸钙,2.2,材料：,水稻、玉米、花生、桑树等植物的新鲜叶片。,2.3,仪器与器皿：,分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管,三,.,实验步骤,1,取样：清洗叶片并擦干,称取,0.5g,叶片，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复,3,次，本实验为减少乙醇或丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。,2,研磨提取：向研钵中加入,96%,乙醇或,80%,丙酮,2ml,，,以及少许,CaCO3(,中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素,),和石英砂，研磨成匀浆，至组织变白，在暗处静止,3-5min,后，用滤纸过滤到,25ml,容量瓶中。,注意：,用滴管吸取,96%,乙醇或,80%,丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用,96%,乙醇或,80%,丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用,96%,乙醇或,80%,丙酮定容至刻度。,3,读取吸光度：取厚度为,lcm,的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗,23,次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的,4/5,，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。,将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有,96%,乙醇或,80%,丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至,663,、,646,、,470nm,处，以,96%,乙醇或,80%,丙酮做为空白对照调透光率,100%,，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定,3,次。注意，每次在转换波长时，都要用,80%,丙酮调透光率,100%,。,4,结果计算：将,645,、,663,、,652nm,处测得的吸光度代入公式（,3,）、（,4,）、（,5,）、（,6,）中计算叶绿素,a,、,b,浓度和总浓度。再将叶绿素,a,、,b,浓度和总浓度代入公式（,7,）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素,a,、,b,含量和总含量。,叶片洗净、吸干、去大叶脉,称,0.5g,叶用,乙醇或,丙酮研磨,匀浆过滤（用,乙醇或,丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）,滤液用,乙醇或,丙酮定容至,25mL,置分光光度计测定,(,注意,:,不同提取溶剂波长不同,),四,.,结果计算,4.1,结果计算,C(mg/L),提取液总量（,L,）,稀释倍数,Chl,=,(mg/g,叶,),材料鲜重（,g,）,4.2,比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同种植物在不同生长环境下,Chla/Chlb,差异。,五,.,注意事项,注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差,叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释,注意分光光度计的规范使用,六,.,思考题,为什么植物在不同生长环境下其,Chl,含量有差异？,Chla,/,Chlb,有何适应意义？,