过程中常见问题及处理方法.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,过程中常见问题及处理方法,过程中常见问题及处理方法,c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂,电极不平衡或者加样位置偏斜,尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）,封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20,可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全,更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）,更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶）,目的蛋白的表达特性分析,过程中常见问题及处理方法,Western blot 结果曝光问题,a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；,可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全,转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；,增加洗涤次数，增加洗膜次数,凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形,WB,的简介,WB,即蛋白质印迹法（,Western Blot,）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。,基本原理,通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。,应用,1.,目的蛋白的表达特性分析,2.,目的蛋白与其它蛋白的互作,3.,目的蛋白的组织定位,4.,目的蛋白的表达量分析,a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素,设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度,转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；,c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反,2、一抗或/和二抗浓度低,它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。,更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）,凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形,目的蛋白的表达特性分析,增加洗涤次数，增加洗膜次数,样品中含有不溶性颗粒,目的蛋白的表达特性分析,根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。,因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。,c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反,三、,WB,的影响因素,步骤较多，任何一步都可能影响结果,1,、电泳分离蛋白,蛋白抽提；,蛋白定量；,样品制备变性；,上样量；,电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）,2,、转膜,膜的选择；,膜的确认；,特殊处理；,3,、封闭,封闭液的选择；,封闭条件优化；,4,、漂洗,漂洗液的配制与选择,漂洗时间及次数,5,、抗体孵育,抗体及稀释液选择；,抗体稀释倍数优化；,抗体孵育时间；,6,、曝光,曝光时间的掌控,四、注意事项,1.,蛋白样品的提取,尽可能新鲜组织或蛋白,避免反复冻融,对于有些蛋白，加去磷酸化的（,NaF,）,尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）,选择合适的裂解液,准确定量（,BSA,标准蛋白）,a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素,d转膜过程产生大量的热，注意冷却,封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20,因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。,增加抗体浓度；,更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）,a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；,根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。,可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性,a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；,玻璃板底部放平，尽量不能漏胶,水或异丙醇压的时候，不能太久,b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化,增加洗涤次数，增加洗膜次数,水或异丙醇压的时候，不能太久,2,、制胶,根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。,制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留的胶。,玻璃板底部放平，尽量不能漏胶,灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝,水或异丙醇压的时候，不能太久,3,、转膜,a,泡膜：,转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡,20min,；,凝胶若是没在预冷的转膜,buffer,中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形,bPVDF,膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化,c,膜顺序：阴极碳板,+,海绵,+,三滤,+,胶,+,膜,+,三滤,+,海绵,+,阳极碳板，不能放反,d,转膜过程产生大量的热，注意冷却,e,具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短,f,避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。,g,夹好膜和凝胶后，确定在凝胶,/,膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全,h,保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率,i,一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景,4,、封闭,a,脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素,b,如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化,c,检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白,/,脱脂奶粉作为封闭剂,5,、孵育,a,洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景,；,b,注意一抗二抗的匹配,c,一抗二抗的效价问题,五、常见问题及解决,电泳中的问题,条带呈笑脸状,凝胶不均匀冷却，中间冷却不好,;,电泳系统温度偏高,条带呈皱眉状,可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全,拖尾,样品溶解不好,纹理（纵向条纹）,样品中含有不溶性颗粒,条带偏斜,电极不平衡或者加样位置偏斜,条带两边扩散,加样量过多,Western blot,结果曝光问题,背景过高且不均匀,1,、封闭不充分,延长封闭时间；,更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，,BSA,，血清等）,2,、一抗浓度过高,增加一抗稀释倍数；,3,、,抗体孵育温度过高,4,孵育,4,、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应,设置二抗对照,(,不加一抗,),降低二抗浓度,5,、,洗膜不充分,增加洗涤次数，增加洗膜次数,没有阳性条带或很弱,1,、一抗、二抗等不匹配,订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或,/,和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性,更换更好的一抗二抗,2,、一抗或,/,和二抗浓度低,增加抗体浓度；,长孵育时间；,3,、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应,封闭时使用温和的去污剂，如,TWEEN20,更换封闭剂（常用的脱脂奶、,BSA,、血清或明胶）,4,、样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过,设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔,20-30ug,蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目,5,、转膜不充分,或洗膜过度,使用丽春红,S,检测转膜效果,PVDF,膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜,