CD147在胃癌细胞SGC7901增殖.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,RNA,干扰抑制,CD147,表达对人胃癌细胞,SGC7901,增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响,2010.5.18,王书奎,MD,PhD,南京医科大学附属南京第一医院,报告内容,研究背景,研究目标,实验方法与结果,实验结论,一、研究背景,胃癌概况,胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而,死亡率较高,。,MMP,简介,肿瘤的,侵袭和转移,是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与,细胞外基质金属蛋白酶,（,extracellular,matrix metalloproteinase,，,MMP,）的参与密不可分。,MMP,是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现,26,种。,MMP,的主要功能是,降解细胞外基质,。肿瘤细胞利用,MMP,的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，,MMP,往往高表达。,20,世纪,80,年代，,Biswas,实验室从人肺癌细胞株,LX-1,的细胞膜上分离得到了一种,58,kDa,的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成,MMP-1,的功能，将其命名为,肿瘤胶原酶刺激因子,（,tumor,collagenase,stimulating factor,，,TCSF,）。,进一步研究表明,TCSF,不仅能刺激,MMP-1,的产生，还能刺激,MMP-2,、,MMP-3,、,MMP-9,和,MMP-11,等的产生，因此将其重命名为,细胞外基质金属酶诱导因子,（,extracellular,matrix metalloproteinase inducer,，,EMMPRIN,),。,第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将,EMMPRIN,命名为,CD147,。,CD147,的结构,CD147,属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的,4,个半胱氨酸残基形成,2,个二硫键，构成,2,个典型的半球形,Ig,结构域。,细胞内的,CD147,存在,低糖基化,（,low,glycosylated,CD147,，,LG,）,和,高糖基化,（,high,glycosylated,CD147,，,HG,）,形式，分子量分别是,3244kDa,、,4565kDa,。只有,HG,形式能刺激,MMP,的产生。,CD147,的功能,CD147,是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、,肿瘤的侵袭和转移,、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个,多功能,的分子。,免疫组化实验证实,CD147,在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且,肿瘤的恶性程度越高，,CD147,的表达水平也越高。,CD147,在肿瘤发生发展中的作用,1.,促进肿瘤的侵袭和转移,CD147,就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种,MMP,来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。,2.,诱导肿瘤血管生成,血管内皮生长因子（,vascular endothelial growth factor,，,VEGF,）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程,。,CD147,可以诱导,VEGF,的表达,。,3.,促进肿瘤细胞多药耐药,在多种,多药耐药,的肿瘤细胞中都观察到,CD147,的高表达。,CD147,可激活,PI3K/AKT,细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。,胃癌中,CD147,的表达,日本,Toyama,大学的,Zheng,HC,等研究表明：在,正常胃黏膜,发展为,增生性或化生性胃黏膜,，最后发展为,胃癌,的过程中，,CD147,的表达量是逐渐增加的，并且,CD147,的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及,MMP-2,、,MMP-9,和,VEGF,的表达呈正相关。,胃癌组织中,CD147,的表达,CD147,在胃癌组织中高表达,二,.,研究目标,本实验旨在运用,RNA,干扰技术抑制胃癌细胞株,SGC7901,中,CD147,基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨,CD147,在胃癌中的作用。,三、研究方法及结果,CD147shRNA,真核表达载体的构建与鉴定,转染,SGC7901,细胞，筛选稳定表达干扰载体的,SGC7901,细胞株,MTT,法检测,SGC7901,细胞增殖水平的变化,明胶酶谱法检测,SGC7901,细胞,MMP-2,、,MMP-9,分泌的变化,SGC7901,细胞体外侵袭力测定,MTT,检测,SGC7901,细胞顺铂敏感性的变化,技术路线,技 术 路 线,胃癌细胞株,SGC7901,源自一位,56,岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明，该细胞表面,CD147,是高表达的,。,shRNA,（,short hairpin RNA,）表达载体的构建,pSilencer3.1-H1 neo,shRNA,模板的设计示意图,干扰靶序列的选择,参考,陈翔等的报道，选取,CD147mRNA 370-390,和,808-828,作为靶序列，相应的,shRNA,分别命名为,shRNA1,和,shRNA2,。另外，设计一个阴性对照,shRNA,-control,。,RNAi,靶序列在,CD147 mRNA,上的位置,1,AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC,51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG,101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA,151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG,201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA,251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC,301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC,351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTG,A AGTCGTCAGA ACACATCAAC,GAGGGGGAGA,401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG,451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC,501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA,551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC,601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG,651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG,701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC,751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA,801 GCACCAG,AAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG,CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG,851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG,901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC,951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT,设计好的,shRNA,插入序列,shRNA1,5-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3,5-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3,shRNA2,5GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3,5AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3,shRNA,-control,5GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3,5AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3,2,、,CD147,shRNA,表达载体的构建：,将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用，与经,Bam,H,I,和,Hin,d III,双酶切的,pSilencer3.1-neo,质粒连接，构建成,CD147,shRNA,表达载体，重组质粒分别命名为,pSilencer-shRNA1,，,pSilencer-shRNA2,和,pSilencer-shRNA-control,。,重组质粒测序鉴定结果,DNA,测序表明，,3,个重组质粒构建正确。,pSilencer/shRNA1,测序图（红线为插入片段）,转染及筛选,脂质体转染,48h,后用含,0.4g/ml,的,G418,的完全培养基筛选,2,周，然后改为半量维持。将抗,G418,的阳性细胞克隆用有限稀释法分离出来并逐步扩增以待进一步分析。筛选出的细胞克隆分别命名为,SGC7901/shRNA1,，,SGC7901/shRNA2,和,SGC7901/shRNA-control,。,Real-time PCR,检测,CD147 mRNA,表达水平,与,SGC7901,相比，,SGC7901/shRNA1,和,SGC7901/shRNA2,细胞中,CD147 mRNA,相对表达量分别下降至,72.4%,和,17.3%,。,1 2 3 4,HG,LG,CD147,-actin,Lane 1:SGC7901.,Lane 2:SGC7901/shRNA-control,Lane 3:SGC7901/shRNA1,Lane 4:SGC7901/shRNA2,HG,代表高糖基化形式的,CD147,，,LG,代表低糖基化形式的,CD147,。,Western blot,结果与,Real-time PCR,结果相符。,接种细胞,培养细胞,加入,MTT,呈色,终止培养,比色,结果计算,抑制率,(%)=(,对照组,A,值,-,实验组,A,值,),对照组,A,值,100%,24h,、,48h,、,72h,时间点,MTT,细胞增殖实验,与,SGC7901,和,SGC7901/shRNA-control,相比，培养,24h,、,48h,、,72h,后,SGC7901/shRNA2,细胞增殖能力均显著降低,.,而阴性对照组,SGC7901/shRNA-control,增殖能力无显著改变。,明胶酶谱法检测细胞上清中,MMP-2,和,MMP-9,的活性,明胶酶,包括,72,kDa,的明胶酶,A,（基质金属蛋白酶,-2,，,MMP-2,）和,92,kDa,的明胶酶,B(,基质金属蛋白酶,-9,，,MMP-9),。,其作用底物为基底膜中的,型胶原和,变性的间质胶原（明胶），,其活性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关。,明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。,明胶酶谱结果,MMP-2,MMP-9,1 2 3,Lane 1:SGC7901.,Lane 2:SGC7901/shRNA-control.,Lane 3:SGC7901/shRNA2,*,*,B,SGC7901/shRNA2,细胞上清液中,MMP-2,和,MMP-9,的活性明显降低,Transwell,原理,Matrigel,是从小鼠,EHS,肉瘤中提取的基质成分，含有,层粘连蛋白,、,型胶原等。将,Matrigel,铺在,Transwell,侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。,Transwell,结果,穿过,Transfer,侵袭小室的染成紫色的细胞（,400,）,SGC7901,SGC7901/shRNA-control,SGC7901/shRNA2,SGC7901/shRNA2,细胞 体外侵袭能力显著降低,B,*,顺铂敏感性实验,抗肿瘤药物顺铂的使用浓度以血浆峰浓度（,Peak,Plasma Concentration,，,PPC),为标准。参照,Sondak,等的报道，顺铂的,PPC,为,3.0,g,/ml,。,本实验中使用的顺铂浓度为：,0.01PPC,，,0.1PPC,，,10PPC,。,细胞生长抑制率（,%,）,=1-OD(cisplatin,）,/,OD(cisplatin,)100%,与,SGC7901,和,SGC7901/shRNA-control,相比，顺铂对,SGC7901/shRNA2,的抑制率显著增加,*,*,*,四、实验结论,成功构建了靶向,CD147,的,shRNA,真核表达载体；,成功转染了人胃癌细胞,SGC7901,，并获得了稳转细胞株，经,Real-time PCR,、,Western Blot,检测，,CD147,在,mRNA,和蛋白水平均被显著抑制；,CD147,表达沉默后,SGC7901,的增殖能力明显降低，细胞的,MMP-2,和,MMP-9,的活性明显降低，细胞的体外侵袭能力明显降低，细胞对化疗药物顺铂的敏感性增强。,我们的研究表明：,CD147,在胃癌细胞,SGC7901,增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；,CD147,可能是胃癌治疗的一个有效的靶点。,下一步的研究方向,1.,动物水平的实验（裸鼠移植瘤模型，体内肿瘤细胞,侵袭实验）；,2.CD147,自身的表达调控；,3.CD147,在其他消化系统肿瘤中的作用；,4.CD147,多药耐药的机制。,Thanks for your attention!,