PCR的原理和操作过程.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PCR,原理和基本操作过程,2015.12.5,临床,146,生化实验小组,第一节,PCR,技术原理,聚合酶链式反应（,polymerase chain reation,PCR)是一种DNA,体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某,DNA,片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的,DNA,供分析研究和检测鉴定。,PCR,技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。,PCR,基本原理,PCR,基本反应步骤,一、,PCR,的原理,PCR,技术是一种在体外模拟,DNA,的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据,DNA,的半保留复制，以及,DNA,分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链,DNA,变性，成为单链,DNA,；其次，单链,DNA,与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在,DNA,聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链,DNA,，实现,DNA,的扩增。,PCR,三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。,二、三个基本步骤,变性,(,denaturation)-,高温下将模板,DNA,双链打开,退火(,annealing)-,引物在较低温度下以共价键结合到模板,DNA,互补部位,延伸,(,extension),-,TaqDNA,聚合,酶作用下，不断向引物,3,端添加,DNTP,，,DNA,链不断延伸,反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：,变性,95,度，退火,55,度，延伸,72,度。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,变 性,第一轮扩增,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,58,引物,1,引物,2,DNA,引物,退 火,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,延 伸,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,Taq,Taq,Taq,Taq,72,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,PCR,的特点,第二节,PCR,的实验步骤,标准的,PCR,反应体系,10,X,扩增缓冲液：,5l,模板,DNA:0.12g,引物：各0.21,mol/L,4,种,dNTP:,各200,mol/L,Mg,2+,:1.5mmol/L,Taq DNA,聚合酶：2.5,U,ddH,2,O,补齐,总体积：,5,0,l,可以按照比例放大或者缩小体系，不同的,PCR,反应需要优化,按照实验方案进行即可,1.,加样,将上述总体积为,50,l,的反应体系加入一无菌,0.5ml,离心管中,2,离心,将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上,3,扩增,在,PCR,仪上设置,PCR,反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：,94,下加热,4,分钟左右；依次,94,变性,1,分钟，,45,退火,1,分钟，,72,延伸,2,分钟，循环,32,次左右；,72,下保温,7,分钟，使反应产物扩增充分,4PCR,扩增产物分析,PCR,产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法,PCR,循环参数,94,，,3min,；,94,，,45s,；,58,，,1min,；循环,30,次,72,，,1min,；,72,，,10min,；,16,保温,（热力学参数）,94,，,3min,；,94,，,45s,；,58,，,1min,；循环,30,次,72,，,1min,；,72,，,10min,；,16,保温,94,预变性，,3min,使,DNA,双链完全打开,退火：,58,，,1min,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,变性：,94,变性，,45s,使双链,DNA,解链为单链,延伸：,72,，,1min,温度为,Taq,酶最适反应温度,72,时间由扩增片段的长度决定,1min,扩增,1KB,