高效液相色谱—仪器与分离模式.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,高效液相色谱,（,High Performance Liquid Chromatography,HPLC,）,仪器与分离模式,侯 建 军,3.4,检测系统,HPLC,检测器分类、性能指标,几种常用的检测器,通用型检测器：,示差折光,介电常数,电导,蒸发光散射检测器,专用型检测器：,紫外,荧光,电化学,放射性检测器,A HPLC,检测器分类、性能指标,性能指标：,噪声,(Noise,No),和漂移,(Draft),：,高频噪音（毛刺）、短周期噪音（通常与泵、流动相有关）上漂、下漂,灵敏度：,S=,响应值,/,样品量或浓度,检测限：,两倍噪声时的样品量,检测器线性范围：,应尽可能大,检测器死体积：,要求小于组分峰体积的,1/10,。目前都小于,8,微升,检测器响应时间：,要求,10(,通常,20mm)25cm 20-30um mg-g,级，,采用粗颗粒填料，制备柱柱效明显低于分析柱，但样品处理量大、成本低，并可降低对大流量泵的要求。,输液泵：分析型一般最大,10ml/min,，,制备型一般需要,100ml/min,最大,1000ml/min,由于颗粒大，柱压降小，对工作压力要求不高，一般达,10MPa,。,有些厂家提供半制备泵，流量,22.5ml/min,。,可以满足不同的需要。,B,检测器、进样器与组分收集器,检测器：进样量大，对灵敏度要求不高，常用示差折光检测器，但要求线性范围宽，流量大需要大体积检测池，或分流。一般不用电化学检测器（会破坏样品）。,进样器：可以用六通阀或单独的进样泵进样，尽量采用低浓度、大体积进样,组分收集器：手动收集、自动收集（定时间或定体积）、或由工作站控制全自动收集。,C,再循环技术与模拟流动床技术,再循环技术：利用柱切换技术再循环提高纯度,模拟流动床技术：工业化制备技术，在精确过程模拟的基础上，采用计算机控制电磁阀切换流路，最大限度利用固定相，降低成本，提高产量。,3.7,阀切换技术,样品的净化与富集,多维色谱,再循环,反向冲洗,4.,基本分离模式,液液色谱,液固色谱,离子交换色谱,分子排阻色谱,1.1,液液分配色谱,组分在固定相与流动相之间存在分配平衡，利用平衡常数的差异实现分离。,正相色谱,流动相极性小于固定相极性的方法,反相色谱,流动相极性大于固定相极性的方法,正相色谱,流动相极性小于固定相极性的方法,例如,以含水硅胶为固定相，烷烃为流动相。,前面介绍过。,1941,年 英国生物化学家,Martin,（,诺贝尔奖）与英国化学家,Synge,创立分配色谱。以水份饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸,反相色谱,流动相极性大于固定相极性的方法,例如：以正辛烷为固定相，水为流动相。,1950,年,Howard,和,Martin,分离石蜡油,液液分配色谱由于固定液易流失，逐渐被键合相色谱法和不要载体的逆流色谱取代，目前使用很少。,4.2,液固吸附色谱,类似普通柱层析的方法,组分在固定相与流动相之间存在吸附平衡，利用平衡常数的差异实现分离。,A,常用吸附剂,主要为硅胶，,氧化铝因为有催化性能，目前不太使用。,硅胶：,表面硅醇基,是吸附活性点。,吸附能力和含水量有关。,活化,（加热脱水，建立吸附活性）与,去活,（加水平衡，钝化强活性点，减,少拖尾）,活化方法：,加热脱水，但不能破坏硅醇基,见参考书,B,流动相,常用溶剂为,正己烷,二氯甲烷,乙腈,甲醇,吸附顶替模型,样品,S,与流动相,M,分子在吸附剂,A,表面上的竞争吸附,S,m,+,nM,a,S,a,+,nM,m,式中下标,m,和,a,分别代表流动相和固定相吸附剂,n=A,s,/A,m,A,s,为组分分子吸附在表面上所需要的吸附剂面积；,A,m,为流动相分子所需面积,净吸附能,E,a,S,-A,s,式中，,S,为组分分子的吸附能；,为溶剂分子在单位面积标准吸附剂上的吸附能。规定，戊烷在氧化铝吸附剂上的吸附能,0,，则,与组分无关，称为称为溶剂强度参数。,溶剂在硅胶上与在氧化铝吸附剂上的洗脱能力有近似关系：,硅胶,=0.77,氧化铝,从,看,k,，,越大，,k,越小。对于给定组分和吸附剂：,lgk,。,根据,大小调节溶质保留。但使用不同流动相时，各组分的,k,不一定一样，所以分离结果不同。可以在相近的,值选择流动相来改善分离。,硅胶上一些溶剂的洗脱能力序列见（,溶剂强度表）,C,样品分子结构对保留的影响,样品分子结构决定着组分的流出次序。组分的保留受分子中官能团的类型和数目的影响。官能团的吸附强度大致如下：,不吸附：,烷烃,弱吸附：,烯烃，硫醇（醚），单环、双环或卤代芳烃,中等吸附：,多核芳烃、醚、腈、硝基化合物、大多数羰基化合物,强吸附：,酚、醇、胺、酰胺、亚砜、酸和多功能团化合物,一般地，含弱吸附与部分中等吸附官能团组分的分离，可以用烃类作洗脱液,含羰基化合物，用二氯甲烷作洗脱液,其余组分的分离，则在洗脱液中添加乙腈或甲醇,D,液固色谱的优势,分离位置异构体,4.3,离子交换色谱,(ion exchange chromatography,IEC),与,离子色谱,(ion chromatography,IC),4.3.1,离子交换色谱,主要用于分离离子。,包括可转化为离子的中性有机物,如：在不同,pH,的氨基酸，与硼酸络合的糖。,A,原理,样品离子,A,在离子交换固定相上与洗脱液同种离子,E,的离子交换,xA,m,y,+,+,yE,s,x,+,xA,s,y,+,+,yE,m,x,+,lgk,=,常数,-(,y/x)lgE,x+,m,B,离子交换剂,固定相,根据键合的官能团性质分为：,阳离子交换剂,强酸性（磺酸型）、弱酸性（羧酸型）,阴离子交换剂,强碱性（季铵型）、弱碱性（胺基型）,强酸性,(pH2),和强碱性,(pH8),和弱碱性,(pH Ba,2+,Pb,2+,Cd,2+,Co,2+,Zn,2+,Mg,2+,Tl,+,Ag,+,K,+,NH,4,+,Na,+,H,+,Li,+,强碱性阴离子交换剂上一些阴离子的洗脱顺序为：,柠檬酸根,草酸根,I,-,HSO,4,-,NO,3,-,Br,-,Cl,-,HCOO,-,CH,3,COO,-,OH,-,F,-,使用不同的离子交换剂，顺序稍有不同。对弱酸、弱碱性离子交换剂，顺序基本不变。,但仅是一般规律。在高温、高浓度、存在络合剂、非水介质中，顺序会发生改变。,pH,变化，影响弱酸、弱碱性离子交换剂的容量；影响离子形式的组分浓度,常用缓冲液,阳离子交换：醋酸、甲酸的钾、钠盐,阴离子交换：氨、吡啶,甲醇、乙腈主要用于增加溶解度（对分子量较大、不易洗脱的有机酸碱，可减少,k,，,改善分离）,4.3.2,离子色谱,在离子交换色谱基础上，通过降低本底电导，采用电导检测器进行检测的方法。是阴离子分析的一大突破。,离子色谱分类,根据仪器结构，分为,双柱法,和,单柱法,两种,根据分离原理，可分为,高效离子色谱法,、,高效离子排斥色谱,、和,可动相离子色谱法,。,A.,抑制型离子色谱法,双柱法,在分离柱和检测器之间接上一只抑制柱，以抑制或消除洗脱液的本底电导，同时将待测的样品离子转变成相应的酸或碱。,由于耐腐蚀（洗脱与再生液为酸或碱）等问题，系统压力通常不能超过,10MPa,，,实际上是低压高效液相色谱。,a,高效离子色谱法,b,高效离子排斥色谱法,c,可动相离子色谱,a,高效离子色谱法,使用离子交换树脂为苯乙烯,二乙烯基苯共聚物，部分磺化后用于阳离子交换，在磺化表面上依靠静电力聚集一薄层氨化乳胶用于阴离子交换。,分离柱交换容量低，抑制柱交换容量高,用于阴离子交换的洗脱液：,NaHCO,3,Na,2,CO,3,NaOH,Na,2,B,4,O,7,用于阳离子交换的洗脱液：稀盐酸、间苯二胺二盐酸盐,缺点：抑制柱引起区带展宽，需要再生；,一些重金属离子在抑制柱会水解,改进：纤维抑制柱、薄膜型抑制器,b,高效离子排斥色谱法,Donnan,（,道南）膜平衡原理。离子交换剂骨架和官能团可看作是不可扩散的聚合物，表面液膜可看作“半透膜”。,主要用于有机酸的分离。,分离柱使用高交换容量全多孔型阴离子交换树脂，抑制柱填以银型阳离子交换剂，后接氢型阳离子交换后置柱。,用于阴离子交换的洗脱液：,0.001 M,HCl,弱酸的保留与其离解常数、浓度、洗脱液,pH,等有关，也与树脂性质有关。,c,可动相离子色谱,使用疏水的中性苯乙烯,二乙烯基苯共聚物为固定相，以含有离子对试剂的乙腈（或甲醇）水溶液为流动相。,分离机理与离子对色谱相似。,抑制柱与高效离子色法相同（高交换容量）,分离亲水性阴离子，采用洗脱液为疏水性的碱,分离疏水性阳离子，采用洗脱液为亲水性的酸,用于分析多种疏水离子，如脂肪胺类，脂肪族或芳香族硫酸盐或磺酸盐,B.,非抑制型离子色谱法,单柱法,采用低电导的洗脱液，不需要使用抑制柱。但检测限要差些。,采用大孔苯乙烯,二乙烯基苯共聚物交换树脂或薄壳型树脂,(pH=2-7),。,洗脱液浓度为,10,-3,-10,-5,mol/L,分离阴离子，采用洗脱液为苯甲酸盐、苯二甲酸盐等，以硼酸和吡啶调,pH,。,分离阳离子，采用洗脱液为乙二胺二硝酸盐,C,检测方式,主要为电导检测,离子色谱法常用洗脱液的电导,.,洗脱液 电导（,S/cm,）,4,mM,NaHCO,3,+4,mM,Na,2,CO,3,1200,同上，通过抑制柱,28,1,mM,邻苯二甲酸氢钾,pH6.3 230,0.5,mM,邻苯二甲酸氢钾,pH6.2 112,0.5,mM,邻苯二甲酸氢钾,pH4.4 74 .,也可以用紫外检测、荧光检测或者间接紫外检测。可以省去抑制柱。,