各种染色方法及应用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,各种染色方法及应用,革兰氏染色与细胞壁,C.Gram,（革兰）于,1884,年,发明的一种鉴别不同类型,细菌的染色方法。,革兰氏染色,革兰氏染色,1,、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染,2,、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细,胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。,3,、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后,仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细,菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细,胞呈无色。,4,、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对,涂片进行复染。例如复红，它使原来无色的,革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革,兰氏阳性细菌继续保持深紫色,细胞化学染色,，是一种以,形态,为基础，结合运用,化学,或,生物化学,技术对血细胞内各种化学成分作,定位,、,定性,及,半定量,分析的方法。,用于研究,血细胞生理,、,病理,和化学结构；临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。,细胞化学染色,血细胞化学染色的基本要求是在,原位,显示细胞成分和结构，反应产物应是,有色沉淀物,，具有一定的,稳定,性。,血细胞化学染色可显示,糖原,、,脂类,、,酶,、,蛋白质,等。,（一）,固定,固定有,物理法,与,化学法,，,物理法,为干燥和火焰固定，,化学法,最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）,显示,1,、,偶氮偶联法,：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。,2,、,联苯胺法,：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3,、,普鲁士蓝法,：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。,4,、,雪夫反应,：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。,5,、,金属沉着法,其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）,细胞化学定量,粗略估量,，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。,百分法,，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。,积分法,，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法，这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,一、过氧化物酶染色（,POX,）,【,原理,】,粒细胞,和,单核细胞,的胞浆内的髓,过氧化物酶,（,POX orMPO,）分解,过氧化氢,，释放,新生态氧,，使,无色,联苯胺氧化成,蓝色,联苯胺，后者进一步变成,棕色,化合物沉着于,细胞质,内。,M1-POX(+),过氧化物酶染色临床意义,主要用于,鉴别急性白血病类型,，,急性髓细胞白血病多呈,阳性,反应，以,M3,和,M2,型反应最,强,，,MI,和,M5,型反应较,弱,，故有助于区别,M3,和,M5,型。,急性淋巴细胞白血病,呈,POX,阴性,反应，故为,急性髓细胞,和,淋巴细胞白血病鉴别,的重要指标。,二、过碘酸一雪夫（,PAS),染色,【,原理,】,胞浆内存在,糖原,或,多糖类,物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的,乙二醇基,（,CHOH-CHOH）,经过,碘酸,（,periodic acid）,氧化，转变为,二醛基,（,CHO-CHO），,与,雪夫,(Schiff),试剂中的,无色品红,结合，形成,紫红色染料,而沉积于,胞浆,中。该反应称为过碘酸一雪夫,(PAS),阳性反应。,L1 PAS(+),AML-M6 PAS(+),【,临床意义,】,（,1,）,M6,与巨幼贫的鉴别,M6,的幼红细胞,PAS,可呈,强阳性,，积分明显增高，,巨贫,、再障、溶贫时,PAS,反应为,阴性,。,（,2,）急性白血病的类型鉴别,ALL,，,PAS,呈大块状阳性，也可是阴性，,AML,为,阴性,，急性单核细胞白血病时,原单,核细胞及,幼单,核细胞,PAS,阳性,，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,三、骨髓铁染色,【原理】,正常人骨髓中的贮存铁主要存在于,骨髓小粒,和,幼红细胞,中，骨髓中的铁在,酸性,环境下与,亚铁氰化钾,作用，形成,普鲁士蓝,反应，形成,蓝色,的,亚铁氰化铁,沉淀，定位于含铁的部位，,从而反映骨髓中铁的储存量。,细胞外铁,细胞内铁,环形铁粒幼细胞,【临床意义】,骨髓铁染色是诊断,缺铁性贫血,及指导,铁剂治疗,的重要方法；也是诊断,铁粒幼细胞贫血,的有效方法。,【,基本原理,】,免疫组化是应用免疫学基本原理,抗原抗体反应,，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂,(,荧光素、酶、金属离子、同位素,),显色来确定组织细胞内抗原,(,多肽和蛋白质,),，对其进行,定位、定性及定量,的研究。,免疫组,(,织,),化,(,学,),1.,阻断内源性过氧化物酶活性,2.,加封闭液：,3.,加入一抗（保存液稀释）,4.,加入二抗（即免疫组化试剂盒里的）,5.,显色,6.,封片,免疫组化步骤,免疫组化技术的优点,1,、,特异性强,2,、,敏感性高,3,、,定位准确、形态与功能相结合,流式细胞术,流式细胞术（,FLOW CYTOMETRY）,是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。,它借鉴了,荧光显微镜技术,与,血球计数,原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。,流式细胞术,FC500,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长(,nm),发射波长(,nm),用途 颜色,FITC,488 525,免疫荧光 绿色,PE(RD1),488 575,免疫荧光 橙色,ECD,488 620,免疫荧光 橙红,PeCy5,488 675,免疫荧光 红,PI,488 620 DNA,染色 橙红,PECy7,488 755,免疫荧光 深红,PerCP,488 670,免疫荧光 红,TO,488 525 RNA,染色 绿,PNH(,阵发性睡眠性血红蛋白尿,),HbF(,胎儿血红蛋白,),检测,血小板计数新标准,(,双平台法,),R=,红细胞数,R3/,血小板数,R1(,流式,),血小板数,=,红细胞数,(,血球仪,)/R,(,国际血液学标准化委员会,(ICSH)/,国际实验血液学协会,(ISLH)2001),灵敏度高,(1-400 x10,9,/L),，,重复性好，室内,/,室外变异系数均很小,尤其应用于血小板预输注病人的检测,(,阈值,:20 x10,9,/L),谢谢！,