SNP检测技术教育课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SNP检测技术PPT讲座,内容简介,1,SNP 概 念,2,SNP 特 点,3,SNP 检 测 技 术,4,实 验,SNP 的概念,单核苷酸多态性,(Single Nucleotide,Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的,改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一,条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷,酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。,它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式,SNP在基因组内的形式:,一是遍布于基因组的大量单碱基变异;,二是分布在基因编码区(coding region),称其,为cSNP，属功能性突变。,SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：,（1）,非转录序列,要多于,转录序列,（2）在转录区,非同义突变,的频率,比,其他方式突变,的频率低得多。,SNP 的特点,在遗传学分析中,SNP 作为一类遗传标记得以广泛,应用,主要源于这几个特点:,（1）密度高,SNP在人类基因组的平均密度估计,为 11000 bp,在整个基因组的分布达 310,6,个,遗传距离为 23cM,密度比微卫星标记更高,可以,在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标,记。,（2）富有代表性,某些位于基因内部的SNP 有可,能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代,表疾病遗传机理中的某些作用因素。,SNP 的特点,（3）遗传稳定性,与微卫星等重复序列多态性标,记相比,SNP 具有更高的遗传稳定性。,（4）易实现分析的自动化,SNP标记在人群中,只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个,“+-”或“全无”的方式，而无须象检测限制性片,段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测,量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动,化。,一、SNPs经典检测方法,一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:,1.限制性片段长度多态性法 PCR-RFLP;,2.单链构象多态性法 PCR-SSCP;,3.变性梯度凝胶电泳(dena t ur i ng gradient gel eletrophoresi s DGGE);,4.等位基因特异性 PCR(allele specific PCR,ASPCR)等等,PCR-RFLP方法,原理：,利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片,断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会,出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位,点。,特点：,该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该,限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的,方法之一.,PCR-RFLP原理图,单链构象多态性(SSCP),原理：,单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的,二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖,于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导,致在凝胶上迁移速度的改变。,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分,子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上,的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。,特点：,由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,变性梯度凝胶电泳（DGGE）,原理：,是利用长度相同的双链 DNA片段解链温,度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开,的电泳技术。,电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分,子大小有关,而一旦DNA 泳动到某一点时,即到,达该DNA 变性浓度位置时,使得DNA 双链开始,分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电,场力平衡时,DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。,由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异,使得其,变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条,带。,等位基因特异 PCR(AS-PCR),原理：,根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特,异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-,PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引,物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没,有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增,产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,SNPs高通量的检测方法,另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通,量、自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用,的有:,1.DNA测序法;,2.DNA芯片检测;,3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;,4.变性高效液相色谱(DH PLC)法等等,DNA测序法,直接测序是最容易实施的SNP检测方法。,原理,:,通过对不同个体同一基因或基因片段进行测,序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检,出率可达100%。,特点：,可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分,型所需要的重要参数。,基因芯片技术(Genechips),原理:,是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的,载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好,的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出,待测序列的碱基类别。,特点：,基因芯片具有信息量大和自动化程度高的,突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所,需设备贵重,不利于普及应用。,MALDI-TOF,原理：,是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上,的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基,不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基,的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。,变性高效液相色谱(DHPLC),原理：,目标核酸片段,PCR,扩增，部分加热变性后，含有突变,碱基的,DNA,序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异,源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同,源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。,SNPs,的有无最终表现为色谱峰的峰,形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的,碱基。,特点：,使用高效液相色谱检测,SNPs,具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知,SNPs,的准确率可达,95%,以上。但,DHPLC,检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。,MassARRAY,SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术,是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过,引物延伸或切割反应,与灵敏、可靠的,MALDITOF,质谱,技术相,结合，实现基因分型检测。,基于MassARRAY 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术,可以设计最高多达,40重PCR反应和基因型检测,，实验设计非,常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对,全基因组研究,发,现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的,情况。,MassARRAY技术原理:,先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列,特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将,制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的,真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离,子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过,检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分,析物的精确分子量，从而,检测出SNP位点信息。,MassARRAY技术原理:,MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。,MassARRAY技术流程：,应用：,1.确定基因多态性和疾病的关系2.解释个体间的表型差异对疾病的易感程度3.对未来疾病做出诊断4.研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药5.个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医鉴定及个体识别,优势,（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；,（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；,（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；,（4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；,（5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；,（6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的4重反应；,（7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。,（8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。,