生物化学第一章蛋白质.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 蛋白质,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能,第二节 氨基酸,第三节 肽,第四节 蛋白质的分子结构,第五节 蛋白质结构与功能的关系,第六节 蛋白质的理化性质,第七节 蛋白质的分离纯化与鉴定,第八节蛋白质组学简介,1,、,掌握基本氨基酸的结构、分类、性质以及肽的概念特点，分离纯化的基本方法。,2,、重点掌握蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系，蛋白质的分离纯化方法、技术。,本章学习重点,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能,一、蛋白质的元素组成,二、蛋白质的分类,三、蛋白质的生物学功能,一、蛋白质的元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物,，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：,碳,50,氢,7,氧,23,氮,16%,硫,0,3,其他 微 量,蛋白质的含氮量,蛋白质的平均含氮量为,16%,，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是,凯氏（,Kjedahl,）定氮法,测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：,蛋白质含量,=,蛋白氮,6.25,6.25,为,蛋白质系数,，即,1,克氮所代表的蛋白质量（克数）,三聚氰胺粉末,不溶于冷水，溶于热水，微溶于乙二醇、甘油、乙醇，不溶于乙醚、苯、四氯化碳,遇强酸或强碱水溶液水解。,三聚氰胺含氮量高达,66.6%,其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。,外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，细胞中的大多数可溶性蛋白质如胞质酶类，属于此类。,球状蛋白质（,globular protein,）：,分子类似纤维或细棒。,大都是结构蛋白，如胶原蛋白，角蛋白等。,可分为可溶性纤维状蛋白质（如,肌肉中的肌球蛋白）,和不溶性纤维状蛋白质（,如胶原蛋白，角蛋白等）,。,*,纤维状蛋白质（,fibrous protein,）：,简单蛋白,(simple protein),结合蛋白,(conjugated protein),1,、据分子形状分,2,、据分子组成分,3,、据溶解度分,4,、据生物功能分,简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。,*清蛋白和球蛋白：,albumin and globulin,广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。,*谷蛋白,(,glutelin,),和醇溶谷蛋白,(,prolamin,),：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于,70,80,乙醇中。,*精蛋白和组蛋白,：碱性蛋白质，存在与细胞核中。,*硬蛋白,：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,结合蛋白,除氨基酸外，还含有其它化学成分（辅因子），如：,*色蛋白：含色素物质，如血红蛋白、细胞色素等。,*糖蛋白：含糖类物质，如细胞膜中的糖蛋白等。,*脂蛋白：含脂类。，如血清,-,，,-,脂蛋白等。,*核蛋白：含核酸结合而成，如核糖体。,1,、据分子形状分,2,、据分子组成分,3,、据溶解度分,4,、据生物功能分,清蛋白、球蛋白、,谷蛋白、醇溶蛋白等,根据溶解度：,清蛋白：又称白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白,球蛋白：微溶于水，溶于稀中性盐溶液。如大豆球蛋白,谷蛋白：不溶于水、醇及中性盐溶液。但溶于稀酸、稀碱。如米、麦蛋白,醇溶蛋白：不溶于水、溶于,70-80%,的乙醇。如玉米蛋白,另外还有精蛋白、组蛋白、硬蛋白等,酶、结构蛋白、运输蛋白、营养和储存蛋白、收缩蛋白和运动蛋白、防御蛋白、调节蛋白,1,、据分子形状分,2,、据分子组成分,3,、据溶解度分,4,、据生物功能分,三、蛋白质的生物学功能,1,、催化功能,酶类,2,、结构功能,（胶原蛋白；韧带中的弹性蛋白；头发、指甲,和皮肤中的不溶性角蛋白；蚕丝、蛛网）,3,、营养和储存功能,（,卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白,）,4,、运输功能,（,血红蛋白、肌红蛋白,）,5,、收缩或运动功能,（骨骼肌收缩,肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动的结果）,6,、激素功能,（,胰岛素,）,7,、保护和防御功能,（蛋白质抗体和免疫球蛋白）,8,、接受和传递信息功能,（受体蛋白,）,9,、调节或控制细胞的生长、分化和遗传信息的表达功能,（组蛋白、阻遏蛋白）,蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,小结,第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能,一、蛋白质的元素组成,二、蛋白质的分类,三、蛋白质的生物学功能,第二节 氨 基 酸（,amino acid,）,一、氨基酸的分类,二、氨基酸的理化性质,三、氨基酸的分离分析,蛋白质的水解,根据水解程度,完全水解 氨基酸混合物,不完全水解 大小不等的肽和氨基酸,根据水解方法,酸水解：多数氨基酸稳定，不引起消旋作用；,Trp,完全被破坏，羟基氨基酸部分分解，,Gln,和,Asn,的酰胺基被水解下来。,碱水解：,Trp,稳定；多数氨基酸被不同程度破坏，且产生消旋现象，,Arg,脱氨。,酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但需多种酶协同作用。,水解方法,反应条件,产物,优点,缺点,酸水解,6M HCl,或,4M H,2,SO,4,共煮,20hrs,L-aa,不引起消旋,Trp,被破坏；一部分羟基,aa(,Ser,Thr,),被分解；,Asn,和,Gln,的酰胺基被水解下来,碱水解,5M NaOH,共煮,20hrs,L-aa,和,D-aa,混合物,不破坏,Trp,引起消旋；,Arg,脱氨基生成鸟氨酸,酶水解,生理温度、,pH,肽段和氨基酸混合物,不破坏,aa,不引起消旋,酶解时间长,蛋白质的氨基酸组成,目前已发现的氨基酸有,250,多种。但是组成蛋白质的常见的氨基酸只有,20,种，称为,基本氨基酸,。,各种蛋白质所含的,20,种常见氨基酸的种类和数目各不相同。或者说，,20,种常见氨基酸不同的排列顺序组成了特定的蛋白质。,蛋白质分子中的氨基酸组成与其性质相关。此外蛋白质分子中氨基酸组成及比例与其结构也有一定的关系。,一、氨基酸的分类,根据是否组成蛋白质分为：,1.,蛋白质中常见氨基酸,2.,蛋白质中稀有氨基酸,3.,非蛋白氨基酸,根据,R,侧链极性分类,根据,R,侧链结构分类,从营养学角度分类,1.,常见蛋白质氨基酸（,20,种）,有对应的遗传密码。,近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码,UGA,编码，可能是第,21,种蛋白质氨基酸。,结构通式（脯氨酸除外）,共同特点：,L-,型，羧基相连的,-,碳上连接,-NH,2,，所以都是,L-,氨基酸。,不变部分,可变部分,根据,R,基团极性,20,种常见氨基酸又分为,(1),非极性,R,基团氨基酸：,8,种,Ala Val Leu Ile Phe Pro Trp Met,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸：,7,种,Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Cys,(3),带负电荷,R,基团氨基酸：,2,种,Asp Glu,(4),带正电荷,R,基团氨基酸：,3,种,Lys Arg His,1,、蛋白质中常见氨基酸的结构,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基丙酸,丙氨酸,Ala,nine,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基异戊酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基异己酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,-,氨基,-,-,甲基戊酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,(1),非极性,R,基团氨基酸,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,苯基丙,酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,吡咯烷基,-,-,羧酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,脯氨酸,Pro,line,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,吲哚基丙,酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,脯氨酸,Pro,line,色氨酸,Tr,y,p,tophan,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,甲硫基丁酸,丙氨酸,A,la,nine,缬氨酸,V,al,ine,亮氨酸,L,eu,cine,异亮氨酸,I,le,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine(,F,),脯氨酸,P,ro,line,色氨酸,Tr,y,p,tophan(,W,),甲硫氨酸,M,et,hionine,R,基疏水性大小,Ala,Met,Pro,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,这类氨基酸,R,基的疏水性在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。,特点：不易溶于水,Pro,是唯一的一种,-,亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段,-,螺旋之间的拐角处。,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,氨基乙酸,甘氨酸,Gly,cine,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,羟基丙,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,羟基丁,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,对羟苯基丙,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,谷氨酰胺,Gl,utami,n,e,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,G,ly,cine,丝氨酸,S,er,ine,苏氨酸,T,hr,eonine,酪氨酸,T,y,r,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,谷氨酰胺,Gl,utami,n,e(,Q,),半胱氨酸,C,ys,teine,-,氨基,-,-,巯基丙,酸,特点：这类氨基酸侧链含极性基团，但在生理条件下不解离，易溶于水，,R,侧链能与水形成氢键。,Cys,中,R,含巯基（,-SH,），两个,Cys,的巯基,氧化生成二硫键，生成胱氨酸。,二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。,(3),带负电荷,R,基团氨基酸,-,氨基丁二酸,天冬氨酸,Asp,artate,(3),带负电荷,R,基团氨基酸,-,氨基戊二酸,天冬氨酸,Asp,artate(,D,),谷氨酸,Glu,tamate(,E,),在生理条件下,侧链,羧基,完全解离，带负电荷。,为酸性氨基酸。,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,，,-,二氨基己酸,赖氨酸,Lys,ine,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,胍基戊,酸,赖氨酸,Lys,ine,精氨酸,Arg,inine,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,咪唑基丙,酸,赖氨酸,Lys,ine(,K,),精氨酸,A,r,g,inine,组氨酸,H,is,tidine,在生理条件下，侧链解离，带正电荷。,为碱性氨基酸。,另外，根据,R,侧链的化学结构，,20,种常见氨基酸 可以分为：,脂肪族氨基酸（,15,种）,芳香族氨基酸（,Phe,Tyr,）,杂环族氨基酸 （,Trp,His,Pro,）,从营养学角度分类：必需氨基酸和非必需氨基酸,必需氨基酸：,人和哺乳动物不可缺少但又不能自身合成的氨基酸，只能从食物中补充,。,包括,8,种,（,Ile,、,Met,、,Val,、,Leu,、,Trp,、,Phe,、,Thr,、,Lys,）,“,一家写两三本书来,”,还有,2,种：,Arg,、,His,，人和哺乳动物虽然能够合成，但数量远远达不到机体的需求，尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间，基本上也是由食物中补充，称为,半必需氨基酸。,注：植物和微生物能合成自己全部的氨基酸。,2.,蛋白质中几种重要的稀有氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为,稀有的蛋白质氨基酸。,这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。在,遗传上，不具有遗传密码。,其中重要的有,4-,羟基脯氨酸、,5-,羟基赖氨酸、,N-,甲基赖氨酸、和,3,5-,二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,3.,非蛋白氨基酸（,200,多种）,广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在于蛋白质中的一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。,H,2,N-CH,2,-CH,2,-COOH H,2,N-CH,2,-CH,2,-CH,2,-COOH,-,丙氨酸,-,氨基丁酸,非蛋白氨基酸存在的意义,：,(1),作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：,D-Glu D-Ala,(2),作为一些重要代谢物的前体或中间体,:,-,丙氨酸、鸟氨酸（,Orn,）、胍氨酸（,Cit,）,(3),作为神经传导的化学物质：,-,氨基丁酸,(4),有些氨基酸只作为一种,N,素的转运和贮藏载体,(5),杀虫防御作用,:,如种子中高浓度的刀豆氨酸和,5-,羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能抑制细菌的生长。,绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。,1.,高熔点,2.,一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。,3.,氨基酸一般有味：,如大米的香味（,Cys),、啤酒的苦味（,Val,、,Leu,、,Ile,）,氨基酸的两个重要性质：,氨基酸晶体的熔点高（,200,C,）；氨基酸使水的介电常数增高。,二、氨基酸的理化性质,（一）氨基酸的一般物理性质,二、氨基酸的理化性质,除甘氨酸外，其他氨基酸含有一个手性,-,碳原子，因此都具有旋光性,。,（二）氨基酸的光学性质,1.,氨基酸的旋光性,旋光性：,旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的，称右旋光物质，记为,“,+,”,，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为,“,-,”,。,氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。,除甘氨酸外，其它氨基酸的,-C,原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称,C,原子。,手性中心,（,chiral center,）：当一个,C,原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。,2.,氨基酸的光吸收,构成蛋白质的,20,种氨基酸在可见光区都没有光吸收,，,但在远紫外区,(97%,以上）；,b,、测定蛋白质的分子质量。,（用于估算氨基酸残基数从而估计序列测定工作量的大小）,测定蛋白质一级结构前的要求,分子质量测定的要求并不高，目前用物理化学方法测出的分子质量，误差在,10%,左右就足够了。,常用测定方法有：,凝胶过滤法；,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法；,沉降分析法等,1,、凝胶过滤法,原理：,根据蛋白质的分子量的大小分离，在一定范围内蛋白质的,分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系,。,V,e,/V,o,分子量对数,SDS-PAGE,法测定分子量,1),支持介质,聚丙烯酰胺,(PAGE),丙烯酰胺,为单体，,N,，,N,亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成的具,网状结构的凝胶；,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（,SDS,），使蛋白样品与,SDS,结合形成带,负电荷的复合物,，由于复合物,分子量的不同,，在电泳中反应出,不同的迁移率,。,根据,标准样品,在该系统电泳中所作出的,标准曲线,，推算出被测蛋白样品分子量的,近似值,。,相对迁移率,m,R,=,样品迁移距离（,cm,）,/,染料迁移距离（,cm,）,点样孔,染料迁移距离,样品迁移距离,Mr,=,bm,R,+K,Mr,为蛋白质分子量,m,R,为相对迁移率,b,为斜率,K,为截距。,沉降速度法,一级结构测定步骤,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链的数目（,2,）拆分蛋白质分子中的多肽链,（,3,）断裂多肽链内的二硫键（,4,）,测定多肽链的氨基酸组成（,5,）,分析多肽链的,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段的氨基酸顺序（,8,）确定肽段在多肽链中的顺序（,9,）确定多肽链中二硫键的位置,一级结构测定步骤,根据,N,末端或,C,末端残基摩尔数和蛋白质摩尔数（根据分子质量计算）确定,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链的数目,（,2,）拆分蛋白质分子中的多肽链,（,3,）断裂多肽链内的二硫键（,4,）,测定多肽链的氨基酸组成（,5,）,分析多肽链的,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段的氨基酸顺序（,8,）确定肽段在多肽链中的顺序（,9,）确定多肽链中二硫键的位置,（,2,）拆分蛋白质分子中的多肽链,测定步骤,s,s,HCOOOH,SO,3,H,SO,3,H,多肽链之间有两种结合方式：,非共价键结合：,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍,二硫键结合,:a.,过甲酸氧化,b.,巯基乙醇还原：可在,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍存在下，,用过量的,-,巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（,ICH,2,COOH,）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,（,3,）断裂多肽链内的二硫键,胰岛素,-,巯基乙醇,碘乙酸,（,4,）测定多肽链的氨基酸组成,测定步骤,完全水解，测定每种氨基酸的含量，根据蛋白质分子质量，可以算出蛋白质的氨基酸组成（每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数）,以便选择用何种方法裂解蛋白质。,酸水解：,6 mol/L,的盐酸或,4 mol/L,的硫酸在,105-110,条件下进行水解，反应时间约,10,24,小时。缺点是,Trp,被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如,Ser,、,Thr,、,Tyr,有一小部分被分解；,Asn,、,Gln,侧链的酰胺基被水解成了羧基。,碱水解：用,5 mol/L,氢氧化钠煮沸,20,小时。该法的优点是色氨酸,(Trp),在水解中不受破坏。,酶解：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。,（,5,）分析多肽链的,N,末端和,C,末端,测定步骤,N-,末端,残基,:,2,4-,二硝基氟苯法,丹磺酰氯法,苯异硫氰酸酯法,氨肽酶法,C,-,末端,残基：,肼解法,羧肽酶法,1,、,N,端分析（氨基末端分析）,二硝基氟苯（,FDNB,）法,FDNB,Edman,降解法（苯异硫氰酸酯法）,丹磺酰氯（,DNS-Cl,）法,乙酸乙酯抽提,色谱鉴定,氨肽酶法,氨肽酶是一种肽链,外切酶,，它能从多肽链的,N-,端,逐个向里水解。,根据,不同的反应时间测出酶水解所释放出的,AA,种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道,Pr N-,末端残基顺序。,最常,用为,亮氨酸氨肽酶,，水解以亮氨酸残基为,N-,末端的肽键速度最大。,NH,2,Phe,Glu,Leu.,氨肽酶法测定,N,端的氨基酸,2,、,C-,末端分析（羧基末端分析）,肼解法,苯甲醛,不溶于水,DNFB,DNFB-AA,色谱分析鉴定,水相,羧肽酶法,NH,2,Phe,Glu,Leu.,COOH,Phe,Glu,Leu.,Leu,Glu,Phe,COOH,羧肽酶的种类：,羧肽酶,A,羧肽酶,B,Leu,Pro,Lys(Arg or Pro),COOH,不能切割,不能切割,Leu,Pro,Lys(Arg),COOH,能切割,小结,:,蛋白质的末端分析（,N,、,C,端）,N,末端分析,二硝基氟苯（,FDNB,）法,Edman,降解法,丹磺酰氯（,DNS-Cl,）法,氨肽酶法,C,末端分析,肼解法,羧肽酶,测定步骤,（,6,）,多肽链断裂成多个肽段,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,A1 A2 A3 A4,B1 B2 B3,酶解法,:,胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,化学法：,溴化氰，羟胺,T,rypsinase,：,R,1,=Lys,和,Arg,侧链（专一性较强，水解速度快）。,R,2,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶,（,C,hymotrypsin,）：,R1=Phe,Trp,Tyr;Leu,，,Met,和,His,水解稍慢。,R,2,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,糜蛋白酶,P,epsin,：,R,1,和,R,2,Phe,Trp,Tyr;Leu,以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,R,1,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin,：,R,2,=Phe,Trp,Tyr;Leu,，,Ile,Met,以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,R,2,=Pro,或,Gly,水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,分别从肽链羧基端和氨基端水解,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,谷氨酸蛋白酶：,R,1,=Glu,、,Asp(,磷酸缓冲液,),R,1,=Glu(,磷酸缓冲液或醋酸缓冲液,),精氨酸蛋白酶：,R,1,=Arg,肽链,水解位点,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,化学法：,可获得较大的肽段,溴化氰,(Cyanogen bromide),水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,羟胺（,NH,2,OH,）：,专一性断裂,-Asn,-,Gly-,之间的肽键。也能部分裂解,-Asn,-,Leu-,之间的肽键以及,-Asn,-,Ala-,之间的肽键。,一级结构测定步骤,Edman,法,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链的数目（,2,）拆分蛋白质分子中的多肽链,（,3,）断裂多肽链内的二硫键（,4,）,测定多肽链的氨基酸组成（,5,）,分析多肽链的,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段的氨基酸顺序,（,8,）确定肽段在多肽链中的顺序（,9,）确定多肽链中二硫键的位置,蛋白质测序方法,氨基酸序列分析仪,-,化学测序,（,Edman,反应原理）,酶降解法,（氨肽酶、羧肽酶）,质谱法,（,MS,）,首先修饰肽链中的极性基团，如 氨基的乙酰化（醋酸酐）、,OH,、,COOH,等的甲基化（,CH,3,I,）。经质谱仪获得蛋白质的气相离子,MS/MS,测序一般在,25AA,左右,适于微量多肽,C=O,和,N-H,几乎都平行于螺旋轴,;,3,、每个氨基酸残基的,N-H,与前面第四个氨基酸残基的,C=O,形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。,4,、多肽链中存在脯氨酸时，,-,螺旋中断，并产生一个“结节”,（,1,）,螺旋（,helix,）,CH,CH,2,CH,2,CH,2,=-57,、,=-48,形成因素,：与组成和排列顺序直接相关。,多态性,：多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）；存在尺寸不同的螺旋。,常用,3.6,13,-,螺旋,代表,-,螺旋，,3.6,指每圈螺旋包括,3.6,个氨基酸残基，,13,表示氢键封闭的环内含有,13,个原子。,其它螺旋形式：,3,10,-,螺旋和,-,螺旋（,4.4,16,螺旋）,right-handed helix left-handed helix,R,侧链对,-,螺旋的影响,:,R,侧链的大小和带电性决定了能否形成,-,螺旋以及形成的,-,螺旋的稳定性。,多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸,残基，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的,-,螺旋。,Gly,的,角和,角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成,-,螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成,-,螺旋。,R,基大（如,Ile,）不易形成,-,螺旋,Pro,中止,-,螺旋。,R,基较小，且不带电荷的氨基酸利于,-,螺旋的形成。,（,2,）,-,折叠,-pleated sheet,也是,1951,年,Pauling,等人提出的。,-,折叠片的特点：,多肽链主链处于较伸展的曲折形式（锯齿状），相邻肽链之间或同一肽链的不同肽段借助氢键彼此连成片状结构（主链的,N,H,和,C=0,之间形成氢键）。,氢键与肽链的长轴接近垂直。,侧链,R,基交替地分布在片层平面的两侧。,-,折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的,N-,端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,反平行的重复周期（肽链同侧两个相邻的同一基团之间的距离）为,0.7nm,，平行的为,0.65nm,。,（,2,）,-,折叠,-,折叠存在于球状及纤维状蛋白质（,-,角蛋白）,中。,N,N,N,平行式,反平行式,C,N,N,（,3,）,-,转角,-turn,在,-,转角部分，由四个氨基酸残基组成,;,弯曲处的第一个氨基酸残基的,-C=O,和第四个残基的,N-H,之间形成氢键，形成一个稳定的环状结构。,这类结构主要存在于球状蛋白分子表面。,（,4,）,无规则卷曲,没有一定规律的自由盘曲，往往是酶的结合部位。,核糖核酸酶分子中的二级结构,-,螺旋,-,折叠,-,转角,无规卷曲,示例：纤维状蛋白,角蛋白,胶原蛋白,-,角蛋白（头发）,-,角蛋白（丝心）,弹性蛋白,一根毛发周围是一层鳞状细胞,(scaIe cell),，中间为皮层细胞,(cortical celI),。皮层细胞横截面直径约为,20,m,。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。,毛发性能就决定于,螺旋结构以及这样的组织方式。,角蛋白,是毛发的主要蛋白,三股右手,螺旋向左缠绕,原纤维,9+2,电缆式排列成微原纤维（,8nm,）,聚合成大纤维,毛发的结构单元,卷发,(,烫发,),的生物化学基础,永久性卷发,(,烫发,),是一项生物化学工程,(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为,构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。,这是因为,角蛋白的侧链,R,基一般都比较大，不适于处在,构象状态，此外,角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状,(,螺旋构象,),的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,丝心蛋白,(fibroin),：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。,丝心蛋白是典型的,反平行式,-,折叠片,，多肽链取锯齿状折叠构象。,天然的,-,角蛋白除了丝心蛋白外，还在大多数鸟类、爬行,动物的羽毛、皮肤、爪及鳞片中存在。,有大侧链的,AA,存在，处于无规则区域，增加了伸展度。,四、超二级结构和结构域,1,、超二级结构：是指蛋白质中相邻的二级结构单元,组合在一起，形成有规则的、在空间上能辨认的,二级结构组合体。,已知的超二级结构有三种基本组合形式：,、,X,和,。,超二级结构,（作为纤维状蛋白的主要结构元件）,Rossman,折叠,（,-,螺旋束）,-meander,Greek key topology,rare,(,回形拓扑结构,),(,曲折,),-hairpin,(,-,发夹,),四、超二级结构和结构域,2,、结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。,超二级结构和结构域是组成蛋白质三级结构的结构单元,结构域这一折叠层次的出现不是偶然的,具有结构上的意义,具有功能上的意义,结构域是在大的蛋白质分子内部所形成的两个或多个在空间上可以明显区分的局部区域。,结构域具有独特的空间构象；与分子整体以共价键相连；并承担特定的生物学功能；一个蛋白质分子中结构域之间可以相同或不同。,丙酮酸激酶结构域,4,/,结构域,3-P-,甘油醛脱氢酶结构域,2,+,结构域,木瓜蛋白酶结构域,1,无规则卷曲,+-,螺旋结构域,木瓜蛋白酶结构域,2,无规则卷曲,+-,回折结构域,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-,螺旋,-,转角,-,折叠,二硫键,结构域,1,结构域,2,五蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构,(,Tertiary Structure,),是指在二级结构、,超二级结构和结构域,基础上，肽链的不同区段侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。,维系这种特定结构的力主要有二硫键、氢键、疏水键（疏水作用）、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。,肌红蛋白的三级结构,哺乳动物肌肉中储存氧和运输氧的结构蛋白,由一条多肽链组成，含,153,个氨基酸残基，球状分子，有一个血红素辅基。,全链折叠成八段,-,螺旋，整个分子呈一种外圆中空结构，血红素辅基埋在中间。,具有极性的氨基酸侧链分布在分子外部，疏水基团藏在分子内部，因此肌红蛋白是水溶性的。,1963,年，,Kendrew,；,肌红蛋白,X,晶体分析分三个阶段完成：,X-,射线结晶学分析的,三个阶段,(,揭示原子空间位置,),：,在,3mol/L,的硫酸铵沉淀得到结晶体。,1957,，,分辨率,0.6nm,多肽主链的折叠和走向,1959,，,分辨率,0.2nm,可以辨认分子的侧链基团,1962,，,分辨率,0.14nm,识别所有的氨基酸,固定血红素辅基；,保护血红素铁,Fe(),免遭氧化,（分子内部的疏水环境）；,通常情况下,氧使二价铁氧化,;,血红素单独也使其氧化；在肌红蛋白分子内部,不易被氧化,由于当结合氧时发生暂时性电子重排,氧被释放后铁仍处于亚铁态,能与另一氧分子结合,.,为,O,2,提供一个合适的结合部位,肌红蛋白和血红蛋白在进化中形成的多肽微环境的作用：,蛋白质不能直接与氧发生可逆结合,过渡金属的低氧态（特别是,Fe,2+,和,Cu,+,）具有很强的结合氧的倾向,肌红蛋白和血红蛋白选择了,Fe,2+,作为氧结合部位,铁原子可以是亚铁或高铁氧化态。,只有亚铁态的蛋白质才能结合,O,2,。,某些节肢动物的血蓝蛋白中结合氧的是,Cu,+,血红素辅基,血红素辅基位于一个疏水洞穴中，这样可避免其亚铁离子被氧化。亚铁离子与卟啉形成,4,个配位键，第五个配位键与,93,位,His,结合，空余的一个配位键可与氧可逆结合。,六、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构,(,Quaternary Structure,),是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。,这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为,亚基,或亚单位,Subunit,，它一般由一条肽链构成，但有的,亚基由两条或多条多肽链组成,，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。,维持亚基之间的化学键主要是,疏水作用,。,由,2,个或多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为,寡聚蛋白。,由,1,条肽链组成仅具有三级结构的蛋白质称为,单体蛋白。,维持蛋白质四级结构的作用力同三级结构。,血红蛋白的四级结构：,血液中运输,O,2,和,CO,2,的功能，,血红蛋白还能和,H,+,结合，从而可以维持体内,pH,。,由四个亚基组成的多聚体（,2,2,），,分子量,65000,链由,141,个,AA,残基组成，,链由,146,个,AA,残基组成。,每一亚基三级结构与肌红蛋白相似。,人在不同的发育阶段血红蛋白的种类不同，,成人：,HbA,：,2,2,98%,，,HbA2,：,2,2,2%,胎儿：,HbF ,2,2,当一个亚基与氧结合后，会引起四级结构的变化，使其它亚基对氧的亲和力增加，结合加快。反之，一个亚基与氧分离后，其它亚基也易于解离。这,有利于运输氧。,别构蛋白：,蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。别构蛋白都有别构效应。,别构效应：,蛋白质与配基结合后改变蛋白质的 构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。,别构蛋白的结构特点,都是寡聚蛋白质，有四级结构。,分子中每个亚基上都有活性部位，或者还有别 构部位；某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。,不同亚基各部位之间存在相互作用，部位之间的影响是通过构象变化传递的。,血红蛋白的亚基各有一个血红素，负责结合一分子氧，当其中一个亚基的血红素与氧结合后，立即引起该亚基构象发生变化，这种构象变化随即通过亚基间次级键引起另外,3,个亚基的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，使所有尚未与氧结合的亚基都变成适宜与氧结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。,氧合作用显著改变,Hb,的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从,T,态,R,态）,T,态（,tense state,）紧张态,R,态（,relaxed state,）松驰态。,脱氧血红蛋白中不同亚基间的盐桥,在,2,个,亚基之间还夹着一分子的,2,，,3-,二磷酸甘油酸。,血红蛋白输氧功能和构象变化,O,2,Hb,Hb-,O,2,O,2,血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线,活动肌肉毛细血管中的,PO,2,0 20 40 60 80 100,肺泡中的,PO,2,Myoglobin,Hemoglobin,S,形氧合曲线反应了血红蛋白对 于,O,2,的结合与解离存在协同作用。使血红蛋白更有效地担负输送氧的任务。,煤气中毒的机制,一氧化碳（,CO,）也能与血红素,Fe,原子结合。由于,CO,与血红素的结合能力是,O,2,的,250,倍，因此，人体吸入少量的,CO,即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与,O,2,的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含,O,2,的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的,CO,被,O,2,置换出来。,知识窗,四级结构的意义,四级结构使蛋白质结构更复杂，以便执行更为复杂的功能。比如血红蛋白,是一个四聚体，其,亚基（,链、,链）与肌红蛋白在三级结构上非常相似，但血红蛋白亚基之间相互作用，使它具有比肌红蛋,白,更复杂的功能，除运输氧外，还能运输,CO,2,和,H,+,。,小结,一、蛋白质的一级结构,二、蛋白质的构象,三、蛋白质的二级结构,四、超二级结构和结构域,五、蛋白质的三级结构,六、蛋白质的四级结构,第四节 蛋白质的分子结构,小 结,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,蛋白质的结构层次,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,定义,蛋白质分子中氨基酸的排列顺序,指蛋白质主链的局部空间结构，不涉及氨基酸残基侧链构象,整条肽链中所有原子在三维空间的排布位置,肽链与肽链之间靠非共价键维系的布局和相互作用。即各亚基间的空间排布,表现形式,-,螺旋、,折叠,转角、无规卷曲,结构域,亚基,维系键,肽键（主要）二硫键（次要）,氢键,疏水作用,、离子键、氢键、范德华力,疏水作用（主要）,离子键、氢键，范德华力,意义,各种蛋白质的一级结构不同；一级结构是蛋白质空间构象和特异性生物学功能的基础，但并不是决定空间构象的唯一因素,二级结构是由一级结构决定的。在蛋白质中存在二个或三个由二级结构的肽段形成的模序，发挥特殊生理功能。二级结构为短距离效应,分子量大的蛋白质分子常分割成,1,数个结构域，分别执行不同的功能。三级结构为长距离效应,含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般无生物学功能,第二章 蛋白质,第一节 蛋白质的化学组成,第二节