分子生物学第八章-1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 基因的表达与调控(下)真核基因表达调控一般规律,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,Contents,基因组很小，大多只有一条染色体,结构简炼,存在转录单元多顺反子,原核生物基因组结构特点,有重叠基因,真核基因组结构特点,真核基因组结构庞大,主要由多细胞组成，每个细胞基因组中蕴藏的遗传信息量及基因数量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组有3109bp，为大肠杆菌总DNA的800倍，噬菌体的10万倍左右310,9,bp、染色质、,单顺反子,基因不连续性,断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon),非编码区较多,多于编码序列(9:1),含有大量重复序列,真核基因的表达调控的特点：,原核细胞,环境因素对调控起决定性的作用。群体中每一个细胞对环境变化的反应是直接的和一致的。,真核细胞,基因表达调控最明显的特征,是能在特定时间，特定的细胞中激活特定的基因，实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化、发育，并使生物的组织和器官保持正常功能。,这是生命活动规律决定的，环境因素在其中作用不大。,真核生物基因调控达到了原核生物所不可能有的深度和广度,真核生物基因调控可分为两大类：,第一类,是,瞬时调控或称可逆性调控,，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降，或细胞周期不同阶段酶活性的调节；,第二类,是,发育调控或称不可逆调控,，是真核基因调控的,精髓部分,，决定了真核细胞生长、分化、发育的进程。,根据基因调控发生的先后次序，又可分为：,转录水平调控,转录后水平调控（RNA加工成熟过程的调控，翻译水平的调控，蛋白质加工水平的调控）。,真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异 p282,试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？,武汉大学2003年分子生物学硕士入学试题,8.1,真核生物的基因结构与转录活性,在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。,真核细胞,DNA,与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分,DNA,是裸露的。,高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，一些由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。,真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行,DNA,片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。这种能力在原核生物中极为罕见。,在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。,在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。,真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。,许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程,，,才能顺利地翻译成蛋白质。,真核生物的基因组中有很多来源相同、结构相似、功能相关的基因按功能成套组合，这些基因被称为,基因家族,。,同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个,基因簇,(gene cluster,),。,如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都属于基因家族,8.1.1,基因家族（,gene family),更多时候，同一家族的成员分散在同一染色体不同部位，甚至位于不同染色体上，具有各自不同的表达调控模式。,1、简单多基因家族,简单多基因家族中的基因,一般以串联方式前后相连。,在大肠杆菌中，,16S,，,23s,和,5s rRNA,基因联合 成一个转录单元，各种,rRNA,分子都是从这个转录单位上剪切下来的。,细菌中所有,rRNA,和部分,tRNA,都来自这个分子量为,30S,（约,6500,个核苷酸）的前,rRNA,。,在真核生物中，前,rRNA,转录产物的分子量为,45S,，（约有,14 000,个核苷酸），包括,18S,，,28S,和,5.8S,三个主要,rRNA,分子。,至少,100,处被甲基化,2、复杂多基因家族,复杂多基因家族一般由,几个相关基因家族,构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。现已发现存在不同形式的复杂多基因家族。,海胆组蛋白基因家族：,编码不同组蛋白的基因处于一个约为6 000bp的片段中，分别被间隔序列所隔开。这5个基因组成的串联单位在整个海胆基因组中可能重复多达1 000次。,3.发育调控的复杂多基因家族,血红蛋白是所有动物体内输送分子氧的主要载体，由,22,组成的四聚体加上一个血红素辅基（结合铁原子）后形成功能性血红蛋白。,在生物个体发育的不同阶段出现几种不同形式的,和,亚基。,这是由于在发育不同阶段，编码,和,亚基的基因不同，编码,和,亚基的基因是受发育调控的。,P285,8.1.2 真核基因的断裂结构,真核基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为非编码序列所隔开，形成镶嵌排列的,断裂方式,，因此，真核基因也被称为,断裂基因,。其中编码的序列称为,外显子,，非编码序列称,内含子,。,外显子,(Exon),：真核细胞基因,DNA,中的编码序列，这些序列被转录成,RNA,并进而翻译为蛋白质。,内含子,(Intron),：真核细胞基因,DNA,中的间插序列，这些序列被转录成,RNA,，但随即被剪除而不翻译。,哺乳动物二氢叶酸还原酶基因，全长,25-31kb,左右，但其,6,个外显子总长只有,2kb,。,基因中的内含子数量和大小都不同,。,胶原蛋白基因长约,40kb,，至少有,40,个内含子，其中短的只有,50bp,，长的可达到,2000bp,。,2、外显子与内含子的连接区,外显子-内含子连接区,指外显子和内含子的交界或称边界序列，它有,两个重要特征,：,内含子的两端序列之间没有广泛的同源性,连接区序列很短，高度保守，,每个内含子5 端起始的两个碱基都是GT，而3 端最后两个碱基总是AG，,称为GT-AG法则，是RNA剪接的信号序列。,断裂结构的一个重要特点是,外显子,-,内含子连接区的高度保守性和特异性碱基序列。,T,3、外显子与内含子的可变调控,组成型剪接：,一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA的过程。,选择性剪接：,同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA的过程。,8.1.3 真核生物DNA水平上的基因表达调控,在个体发育过程中，DNA会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物的发育。,DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，,包括基因丢失、扩增、重排和移位等。,这与转录和翻译水平的调控是不同的，,这种调控使基因组发生了改变。,例如：成熟红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，但它的前体细胞是不产生珠蛋白的。这种变化是由于,基因本身或者是基因的拷贝数发生了永久性,变化所调控的。,基因扩增：,基因扩增,是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。,非洲爪蟾的卵母细胞中原有,rRNA,基因（,rDNA,）约,500,个拷贝，在减数分裂粗线期，基因开始迅速复制，到双线期拷贝数约为,200,万个，扩增近,4000,倍，可用于合成,10,12,个核糖体，满足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白质的需要。,基因重排与变换,将一个基因从远离启动子的地方移到较近的位点从而启动转录，被称为,基因重排,。,例如：,P 291 fig 8-11 b,免疫球蛋白的肽链主要由可变区（,V,区）、恒定区（,C,区）以及两者之间的连接区（,J,D,区）组成，,V,、,C,和,J,、,D,基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发育分化时，通过染色体内,DNA,重组把,4,个相隔较远的基因片段连接在一起，产生具有表达活性的免疫球蛋白基因。,8.1.4 DNA,甲基化与基因活性的调控：,1,、,DNA,的甲基化,DNA,甲基化主要形成,5-,甲基胞嘧啶（,5-mC,）和少量的,N6-,甲基腺嘌呤（,N6-mA,）及,7-,甲基鸟嘌呤（,7-mG,）。,DNA甲基化,是最早发现的修饰途径之一；,DNA甲基化,能关闭某些基因的活性，,去甲基化,则诱导了基因的重新活化和表达。,DNA甲基化,能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,研究证实,，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化,导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。,在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。,CpG,二核苷酸通常成串出现在,DNA,上，这段序列被称为,CpG,岛,。,2、DNA甲基化抑制基因转录的机制,DNA,甲基化,导致某些区域,DNA,构象变化，从而影响了蛋白质与,DNA,的相互作用，抑制了转录因子与启动区,DNA,的结合效率。,启动区,DNA,分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。,对于弱启动子来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。,当这一类启动子被增强时（带有增强子），即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。,若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。,P294 fig8-14,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,Contents,真核基因调控主要在转录水平上进行，受大量特定的,顺式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（transacting factor,）调控。真核生物的转录调控大多数是通过,顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用,来实现的。,8.2,真核基因转录机器的主要组成,8.2.1 真核基因的转录,一个完整的基因，不但包括编码区（coding region），还包括5和3端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。所以，,“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA,所必需的全部核苷酸序列。,顺式作用元件,定义：,影响,自身基因,表达活性的,非编码,DNA,序列。,例：启动子、增强子等,（,1,）启动子：在,DNA,分子中，,RNA,聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。,真核基因启动子由,核心启动子和上游启动子,两个部分组成，是在基因转录起始位点（,+1,）及其,5,上游大约,100,200bp,以内的一组具有独立功能的,DNA,序列。,核心启动子：,是指保证,RNA,聚合酶,II,转录正常起始所必需的、最少的,DNA,序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游,-25-30bp,处的,TATA,盒。,上游启动子：,包括通常位于,-70bp,附近的,CAAT,盒（,CCAAT,）和,GC,盒（,GGGCGG,）,等。,（,2,）,增强子,：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的,DNA,序列。,SV40,的转录单元上发现，转录起始位点上游约,200 bp,处有两段长,72 bp,的正向重复序列,。,若把增强子上两个,72bp,重复序列同时删除，基因表达水平会降低很多。,增强子特点：,增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍,增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3,kb，,或在靶基因下游，均表现出增强效应；,大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：,（G）TGGA/TA/TA/T（G），,该序列是产生增强效应时所必需的；,增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明增强子只有与特定的蛋白质（转录因子）相互作用才能发挥其功能；,没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；,许多增强子还受外部信号的调控，,如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,（三）反式作用因子,1、,定义：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的,蛋白质，也称,转录因子,。,转录复合物中，根据各个蛋白质成分在转录中的作用，能将整个复合物分为,3,部分：,1.,参与所有或某些转录阶段的,RNA,聚合酶亚基,，不具有基因特异性。,2.,与转录的起始或终止有关,的辅助因子,，不具基因特异性。,3.,与特异调控序列结合的,转录因子,。,研究较多的转录因子：,TFD,（,TATA box,）、,CTF,（,CAAT box,）、,SP1,（,GGGCGG,）、,HSF,（热激蛋白启动区）,真核生物中转录因子活性调节的主要方式,p300,这些转录因子有两种独立的活性：,1.,首先它们特异地与,DNA,结合位点相结合；,2.,然后激活转录。,这些活性可以独立分配给特定的蛋白结构域，分别称作,DNA,结合结构域,和,激活结构域,。,转录激活功能是与其,DNA,结合活性相分离的，它们在蛋白质的不同区域。,DNA识别或结合域,1.螺旋,-,转折,-,螺旋结构（H-T-H）,这类蛋白质分子中有至少两个螺旋，中间形成,“,转折,”,。,2、锌指结构,配位键,2-9,个,定义：是一种常出现在,DNA,结合蛋白中的结构基元。,是由一个含有大约,30,个氨基酸的环和一个与环上的,4,个,Cys,（半胱氨酸）或,2,个,Cys,和,2,个,His,（组氨酸）配位的,Zn,构成,，形成的结构像手指状。,Cys,2,/Cys,2,锌指,Cys,2,/His,2,锌指,见于,甾体激素受体,见于,SP1,等,类固醇激素受体家族含有连续的两个锌指结构,3、碱性-亮氨酸拉链（bZIP结构）p303,当来自同一个或不同多肽链的两个-螺旋的疏水面（,常常含有亮氨酸残基,）相互作用形成一个二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。肽链氨基端含2030个富碱性氨基酸。,以二聚体形式与,DNA,结合，亮氨酸拉链区并不直接结合,DNA,，肽链氨基端,20,30,个富碱性氨基酸结构域与,DNA,结合，但以碱性区和亮氨酸拉链结构域整体作为基础。,4、碱性-螺旋-环-螺旋（bHLH结构）,在免疫球蛋白,轻链基因的增强子结合蛋白,E12,与,E47,中，羧基端,100,200,个氨基酸残基可形成两个两性,螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，蛋白质的氨基端则是碱性区，其,DNA,结合特性与亮氨酸拉链类蛋白相似。,bHLH,类蛋白只有形成同源或异源二聚体时，才具有足够的,DNA,结合能力。当这类异源二聚体中的一方不含有碱性区（如,Id,或,E12,蛋白）时，该二聚体明显缺乏对靶,DNA,的亲和力。,P305 fig8-22,Contents,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,细胞是生命活动的基本单位。细胞通过DNA的复制和细胞分裂将本身所固有的遗传信息由亲代传至子代，实现增殖繁衍。它们还不断地“感知”环境变化，并对其作出特定的应答。,细胞应答可以分为3,个阶段：,外界信息的“感知”，即由细胞膜到细胞核内的信息传递,染色质水平上的基因活性调控,特定基因的表达，即从DNARNA蛋白质的遗传信息传递过程。,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程,是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。,能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称,配体,(ligand),。,受体的定义,是,细胞膜,上或,细胞内,能特别识别生物活性分子并与之结合的成分。它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质。,受体的分类：目前已知受体种类达百余种。,按部位分类：细胞膜受体和细胞内受体。,按结构分类：单体蛋白受体、跨膜复合蛋白受体。,按效应分类：离子通道偶联受体、G蛋白偶联受体、蛋白激酶偶联受体。,按功能分类：神经递质类受体、激素类受体、自体活性物质类受体。,细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导受体蛋白构象变化，使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内，或使受体发生寡聚化而被激活。,受体分子活化细胞功能的途径主要有两条,：,一是受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递；,二是配体与细胞表面受体结合，通过,G蛋白介异的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传递信号。,G,蛋白,:,受体与配体结合后即与膜上的偶联蛋白结合，使其释放活性因子，再与效应器发生反应。由于这些偶联蛋白的结构和功能极为类似，且都能结合,GTP,或,GDP,，所以通常称,G,蛋白，即鸟苷酸调节蛋白（,guanine nucleotide regulatory protein,）,G protein,细胞表面的受体通过与其相应配体作用后，可经不同种类的,G,蛋白偶联，分别发挥不同的生物学效应。,G,蛋白的种类和结构：,已发现有,40,多种，结构相似，均为异源性三聚体，由,、,、,亚基构成,.,存在于,细胞质膜,上的受体，根据其结构和转换信号的方式又分为三大类：,离子通道受体,，,G,蛋白偶联受体,和,跨膜蛋白激酶受体,。,膜受体,(membrane receptor),P308,真核细胞主要跨膜信号传导途径,蛋白质磷酸化和,GTP,结合蛋白参与的信号转导过程,已发现蛋白激酶基因达2000多个，还有1000多个蛋白质去磷酸化酶基因,根据底物蛋白被磷酸化残基,丝氨酸/苏氨酸型,酪氨酸型,组氨酸型,是否有调节物参与,信使依赖性（胞内信使、调节因子、激素或生长因子）,非信使依赖型,表10、11,依赖于,cAMP,的蛋白激酶称为,A,激酶（,PKA,），,它能把,ATP,分子上的末端磷酸基团加到某个特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上。,8.3.1,受,cAMP,水平调控的,A,激酶,受cAMP水平调控的A激酶,非活性状态的PKA全酶由4个亚基R2C2所组成，分子量约为150-170，调节亚基与cAMP相结合，引起构象变化并释放催化亚基，后者随即成为有催化活性的单体.,8.3.1 受cAMP水平调控的A激酶,依赖于cAMP的蛋白激酶称为A激酶（PKA），能把ATP上的末端磷酸基团加到某个特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上。,被A激酶磷酸化的氨基酸N端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特定氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改变了这一蛋白的酶活性。,不同细胞对,cAMP,信号途径的反应速度不同：,在肌肉细胞,1,秒钟之内可启动糖原降解为葡糖,1-,磷酸（图），而抑制糖原的合成。,糖原代谢时，激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质,cAMP,的合成并活化,A,激酶，后者再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解过程并提供,ATP,。,cAMP,活化糖原磷酸化酶示意图,在某些分泌细胞中，需要几个小时，激活的PKA 进入细胞核，将,CRE结合蛋白,磷酸化，调节相关基因的表达。,许多转录因子都可以通过cAMP介导的蛋白质磷酸化过程而被激活，因为这类基因的5端大都拥有一个或数个cAMP应答元件（CRE）。,CRE（cAMP response element，cAMP,应答元件,）,是DNA上的调节区域。,(TGACGTCA),CRE,结合蛋白,(,cAMP response element bound protein,CREB),cAMP,信号与基因表达,该,信号途径涉及的反应链,可表示为,p311,：,激素G蛋白耦联受体激活G蛋白激活腺苷酸环化酶cAMP 活化依赖cAMP的蛋白激酶A释放催化亚基进入核内 底物（,CREB,）磷酸化激活基因转录,cAMP,信号与基因表达,该,信号途径涉及的反应链,可表示为,p311,：,激素G蛋白耦联受体激活G蛋白激活腺苷酸环化酶,cAMP 活化依赖cAMP的蛋白激酶A释放催化亚基进入核内 底物（CREB）磷酸化激活基因转录,8.3.2 C激酶与PIP2、IP3和DAG,C激酶是一个7.7104的蛋白质，能磷酸化丝氨酸和苏氨酸。具有一个催化结构域和一个调节结构域。,因为该激酶活性依赖于Ca2+，所以称为C激酶（PKC）。IP3和DAG是该途径的主要活性分子，G蛋白通过活化的受体调控磷酸肌醇酶系统的活性。,图8-31,激酶信号传递与基因表达示意图,。,IP3引起细胞质Ca,2+,浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠近原生质膜内侧处，并被DAG和Ca,2+,激活。DAG激活C激酶是因为前者提高了C激酶对于Ca,2+,的亲和力。,磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的两个酶解产物：肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。,8.3.3 CaM激酶及MAP激酶,Ca,2+,的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶（CaM-kinase）来实现，也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，但仅应答于细胞内Ca,2+,水平。,MAP激酶（mitogen-activated protein kinase，MAP-kinase，又称为extracellular-signal-regulated kinase，ERKS）活性受许多外源细胞生长、分化因子的诱导，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受体系统的调控。,图8-32 Ras蛋白和C激酶激活丝氨酸/苏氨酸“瀑布式”磷酸化（级联磷酸化），引起相关生理反应图示,。,MAP-激酶的活性取决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是否都被磷酸化。能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为MAP-激酶-激酶，其反应底物是MAP激酶。,MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，从而在信息传导中发挥功能。,8.3.4 酪氨酸蛋白激酶（PTK）途径,包括跨膜受体家族与胞质非受体家族两大类。,受体类由胞外结合配体结构域、跨膜结构域和细胞质激酶结构域组成，其PTK活性受胞外结构域与配体的调节。配体与受体结合可诱导受体蛋白的二聚化，将受体胞质区酪氨酸残基磷酸化。,c-Src蛋白功能区划分（a）及第416位、527位酪氨酸残基磷酸化或点突变以后对该蛋白质功能的影响（b）。,Src亚家族非受体酪氨酸激酶以及许多PTK作用底物分子都存在Src同源结构域（Src homology domain，SH）。,正常细胞中，pp60c-Src上的Tyr527被磷酸化并以头尾相连的缔合方式折入同一分子的SH2结构域中，从而抑制了PTK活性。pp60c-Src与靶分子PI3激酶、rasGAP等的缔合作用均涉及pp60c-SrcSH2结构域与PI3激酶及rasGAP分子上酪氨酸磷酸化区的结合。,图8-34 Src激酶活化过程图示,8.3.5 蛋白质磷酸化与细胞分裂调控,细胞通过P53及P21蛋白控制CDK（cyclin-dependent protein kinase）活性，调控细胞分裂的进程。,图8-35 pRb蛋白的磷酸化和去磷酸化过程控制了细胞分裂的周期性,P,21,蛋白过量时，周期蛋白（cyclin）E-CDK2复合物与P,21,蛋白相结合，CDK2丧失磷酸化P,Rb,蛋白的功能。未磷酸化的P,Rb,蛋白与转录因子E2F结合使后者不能激活DNA合成酶基因表达，细胞不能由G1期进入S期，分裂受阻。,如果P,53,基因活性降低，P,21,蛋白含量下降，周期蛋白E-CDK2复合物就能有效地将P,Rb,蛋白磷酸化，与E2F相脱离，使后者激活与DNA合成有关的基因表达，细胞从G1期进入S期，引发细胞分裂。,图8-36 CDK活性受磷酸化和蛋白质水解通路直接调控。,CDK,活性受双重调控,（1）没有周期蛋白，,CDK,无活性。,（2）随着周期蛋白的合成和积累，逐步形成周期蛋白,-CDK,复合物。,（3）,CDK,上的酪氨酸位点被磷酸化，掩盖了其,ATP,结合位点，,ATP,不能有效地与之相结合，,CDK,仍然无活性。,（4）CDK蛋白T-环中的苏氨酸位点被磷酸化，并将其酪氨酸位点上的磷酸基团去掉，CDK蛋白才能发挥其生物学活性。,（5）同时，CDK蛋白还能使细胞中的磷酸酯酶磷酸化，以加速脱去自身酪氨酸位点上的磷酸基团。,（6）有生物活性的周期蛋白,-CDK,复合物能将,DBRP,（,Destruction Box Recognizing Protein,）磷酸化，激活泛素连接酶，把大量泛素加到周期蛋白上并使之迅速降解，,CDK,失活，新的周期开始。,Contents,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,1.组蛋白的乙酰化及去乙酰化,1.1.,组蛋白的基本组成：组蛋白是组成核小体的基本成分，核小体是组成染色质的基本结构单元。,组蛋白,：,H1 H2A H2B H3 H4,非组蛋白,核小体,DNA,蛋白质,染色体,核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的,八聚体,和由大约,200bpDNA,组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。每个核小体只有一个H1。,核小体组成,念珠状结构,，有一条细丝连着一串直径为10nm的球状体。,核小体,1.2.,核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化,核心组蛋白朝向外部的,N-,端部分被称为,”,尾巴,”,可被组蛋白,乙酰基转移酶和乙酰基去乙酰化酶,修饰，加上或去掉乙酰基团。,图：组蛋白,N,端,”,尾巴,”,主要修饰位点,图8-37 已知组蛋白N-端“尾巴”主要被修饰位点,1.3.组蛋白乙酰基转移酶（HAT）,目前已发现的,HAT,有两类：,一类与转录有关,另一类与核小体组装以及染色质的结构有关,。,HAT,并不是染色质结合蛋白，但通过蛋白相互作用影响染色质结构。与转录有关的,HAT,催化亚基是酵母调控蛋白质,GCN5,，具有乙酰化组蛋白,H3,和,H4,的活性。,1.4.组蛋白去乙酰化酶（HDAC）,组蛋白去乙酰化酶负责去除组蛋白上的乙酰基团,负责去除组蛋白上的乙酰基团，研究比较深入的是人类HDAC1和酵母Rpd3，都形成很大的蛋白复合体发挥作用。Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近，并在转录共抑制子Sin3及R的的协同作用下，抑制基因转录。,图8-39 组蛋白去乙酰化酶复合体能与靶基因启动子区结合，抑制基因转录,2.组蛋白的乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响 p320,组蛋白乙酰化的状态与基因表达有关。组蛋白N端“尾巴”上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，,导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，,从和提高了基因转录的活性。,相反，组蛋白去乙酰化与基因活性的阻遏有关。,8.4.3 p53乙酰化对转录活性的影响,p53蛋白的活性受翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化等）机制调控，经修饰的p53蛋白能与不同靶分子或蛋白复合体相结合，抑制或激活参与特定生理反应的靶基因。p53在所有细胞中都转录产生2.2-2.5千核苷酸的mRNA，编码由393个氨基酸组成的分子量为53 kDa的蛋白。,p53蛋白可分为3个不同区域：N端酸性区(1-80位氨基酸残基)；C端碱性区(319-393位)和中间(100-300位)的疏水区（图8-40A）,。,Contents,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,1.激素对靶基因的影响,许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素）以及一般代谢性激素（如胰岛素）的调控作用都是,通过起始基因转录而实现的。,8.5,激素与热激蛋白对基因表达的影响,P 323,几种常见的疏水性小分子激素的结构式,1.激素对靶基因的影响,体内存在的许多糖皮质类激素应答基因都有一段大约20bp的顺式作用元件（激素应答元件，简称,HRE,），该序列具有类似增强子的作用，其活性受激素制约。,固醇类激素的受体蛋白分子有相同的结构框架，包括保守性极高并位于分子中央的,DNA结合区，,位于,C端的激素结合区,和,保守性较低的N端,。,N端功能不详，但它的存在保证了转录的高效进行,。,保守性极高,DNA,结合区，,位于,C,端的激素结合区,和,保守性较低的,N,端,。,图示,不同激素受体的,DNA,结合区,类固醇激素通过胞内受体调节生理过程,靶细胞中含有大量激素受体蛋白，而非靶细胞中没有或很少有这类受体。研究表明，,激素，受体，顺式作用元件的结合位点,三者缺一不可。,2.热激蛋白诱导的基因表达,能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为,应答元件,。应答元件主要有：,热激应答元件（HSE）,糖皮质应答元件（GRE）,金属应答元件（MRE,）,应答元件与细胞内专一的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。,2.热激蛋白诱导的基因表达,许多生物在最适温度范围以上，能受热诱导合成一系列热休克蛋白（heat shock protein，HSP），又称,热激蛋白,。,受热后，果蝇细胞内Hsp70 mRNA水平提高1 000倍，就是因为,热激因子（heat shock factor，HSF）,与hsp70基因TATA区上游60bp处的HSE（,热激应答元件）,相结合，诱发转录起始。,不受热或其他环境胁迫时，,HSF,（,热激因子）,主要以单体的形式存在于细胞质和核内。单体,HSF,没有,DNA,结合能力。,受热激或其他环境胁迫时，细胞内变性蛋白增多，与,HSF,竞争结合,Hsp70,，从而释放,HSF,，使之形成三体并输入核内,。,HSF,的三体能与,HSE,（热激应答元件）,特异结合，促进基因转录。,HSF,的这种能力可能还受,磷酸化水平,的影响。热激后，,HSF,不但形成三体，还会,迅速被磷酸化,。,HSF,与,HSE,的特异性结合，引起包括,Hsp70,在内的许多热激应答基因表达，大量产生,Hsp70,蛋白。随着热激温度消失，细胞内出现大量游离,Hsp70,蛋白，它们,与,HSF,相结合，形成没有,DNA,结合能力的单体并脱离,DNA,。,Contents,真核生物的基因结构与转录活性,真核基因转录机器的主要组成,蛋白质磷酸化对基因转录的调控,蛋白质乙酰化对蛋白表达的影响,激素与热激蛋白对基因表达的影响,其它水平上的表达调控,8.6 其他水平上的表达调控,8.6.1 RNA的加工成熟,1,、,rRNA,和,tRNA,的加工成熟,rRNA,加工有两个内容，一个是,分子内的切割,，另一个是,化学修饰,。,真核生物的,rRNA,基因转录时先产生一个,45S,的前体,rRNA,，然后前体,rRNA,很快就会被加工降解，生成不同相对分子质量的成熟,rRNA,。,rRNA,化学修饰：,甲基化,原核生物：,碱基甲基化,真核生物：,核糖甲基化,tRNA,基因转录时也可能先生成前体,tRNA，,然后再进行加工成熟。一般认为，,tRNA,基因的初级转录产物在进入细胞质后，首先经过核苷的修饰，生成4.5,S,前体,tRNA，,再行剪接成为成熟,tRNA（4S）。,编码蛋白质的基因转录产生,mRNA,。,这类基因产物在转录后要进行一系列的加工变化，才能成为成熟的有生物功能的,mRNA,。,编码蛋白质的基因转录时首先生成前体,pre-mRNA(,或称核不均一,RNA,，,hnRNA),，,然后再加工剪接为成熟,mRNA,。,这些加工主要包括在,mRNA,的,5,末端加,帽子,，,在其,3,末端加上,poly(A),，进行,RNA,的剪接,以及核苷酸的,甲基化修饰,等。,由于,mRNA,的这些结构与它作为蛋白质合成模板的功能有密切关系，,所以是基因表达的重要调控环节。,2,、,mRNA,的加工成熟,3、真核生物基因转录后加工的多样性,真核生物的基因可以按其转录方式分为两大类：即简单转录单位和复杂转录单位。,(1,),简单转录单位。,这类基因只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时则不需要加工。这类基因转录后加工有3种不同形式：,简单转录单位转录后加工有,3,种不同形式,第一种简单转录单位，如组蛋白基因，它们没有内含子，因此不存在转录后加工问题，其,mRNA3,末端没有,poly(A),，但有一个保守的回文序列作为转录终止信号,简单转录单位转录后加工有,3,种不同形式,第二种简单转录单位包括腺病毒蛋白,IX,、,-,干扰素和许多酵母蛋白质基因，它们没有内含子，所编码的,mRNA,不需要剪接，但需要加,poly(A),。,简单转录单位转录后加工有,3,种不同形式,第三种简单转录单位包括,和,-,珠蛋白基因及许多细胞蛋白基因，这些基因虽然都有内含子，需要进行转录后加工剪接，还要加,poly(A),，但它们只产生一个有功能的,mRNA,，所以仍然是简单转录单位。,(2),复杂转录单位。,含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子以外，其原始转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的,mRNA。,利用多个5端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质。,利用多个加多聚（,A）,位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质。,前,mRNA,不同的剪接方式造成了不同组织中不同的降钙素样蛋白,虽无剪接，但有多个转录起始位点或加多聚（,A）,位点的基因。,二氢叶酸还原酶基因和酵母乙醇脱氢酶基因都具有不同的5末端和多聚（A）位点。大鼠-2-珠蛋白基因、鸡波形蛋白基因、X基因和人N-ras基因均含有多个多聚（A）位点；鸡溶菌酶基因和酵母蔗糖酶基因则拥有多个5末端。可产生不同5末端的mRNA，分别产生分泌型或胞内型蛋白。,mRNA,有效性的调控,真核生物能否长时间、及时地利用成熟的,mRNA,分子翻译出蛋白质以供生长、发育的需要，是与,mRNA,的稳定性密切相关的。,原核生物,mRNA,的半衰期很短，平均大约,3min,。高等真核生物迅速生长的细胞中,mRNA,的半衰期平均约为,3h,。在高度分化的终端细胞中许多,mRNA,极其稳定，有的寿命长达几天或十几天，加上强启动子的转录，使一些终端细胞特有的蛋白质合成达到惊人的水平。,例如，家蚕丝心蛋白基因具有很强的启动子，几天内即可转录出,10,5,个丝心蛋白,mRNA,，而它的寿命长达,4,天，每个,mRNA,分子能重复翻译出,10,5,个丝心蛋白，所以,4,天内可产生,10,10,个丝心蛋白，,说明,mRNA,寿命的延长是,mRNA,有效性的一个重要因素。,(A)顺式作用元件(B)反式作用元件(C)顺式作用因子(D)反式作用因子(E)顺反式作用元件,对自身基因转录激活具有调控作用的DNA序列,由特定基因编码、对另一基因转录具有调控作用的转录因子,A,D,反式作用因子上的几种重要的DNA结合结构域有:,螺旋,-,转折,-,螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链和碱性,-,螺旋,-,环,-,螺旋,依赖cAMP的蛋白激酶是:,A.PKC,B.PLC,C.CK,D.PKG,E.PKA,E,真核生物DNA中胞嘧啶存在甲基化修饰，绝大