南农动物繁殖学第九章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第九章 配子与胚胎生物工程胚胎移植,本章内容,胚胎移植技术概述,胚胎移植的意义,国内外发展概况,胚胎移植的基本原则,牛胚胎移植操作步骤,山羊胚胎移植概述,八戒飞抵岛城跨国娶妻,加拿大,846,头猪运抵青岛，价值,190,万美元,（,2007-10-17,）,成本高，时间长，可用,ET,代替活体引种。,一、胚胎移植技术概述,1.,定义,胚胎移植是指将一头,良种母畜配种后的早期胚胎取出（或通过体外受精及及其他方式得到体外生产的胚胎），,移植到另一头,同种且生理状态相同,的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。,实际上是由,产生良种胚胎的供体,和,养育胚胎的受体,分工合作共同繁殖后代的技术。,牛胚胎移植技术路线示意图,1890,年 英国第一次兔获得胚胎移植成功,1934,年 绵羊,1949,年 山羊,1951,年 猪,1951,年 牛,1970,年 马,1975,年,1,月 美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会,1980,年代 欧洲使用,MOET,奶牛育种,3.,胚胎移植历史,二、胚胎移植的意义,充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群,加速育种进程,简化良种引进方法,保存品种资源,诱发单胎动物产双胎,研究手段,在胚胎移植中，供体母畜职能是生产遗传性能优秀的胚胎，而胚胎后期发育完全可以由遗传性能一般的代孕受体来完成。,母畜再通过促性腺激素处理后，一个发情周期中生产的胚胎数将比自然状态多几倍到几十倍，通过胚胎移植其繁殖力可提高几十甚至是几百倍。,1.,充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群,以奶牛为例，按照目前的技术水平，供体母牛每隔,60d,可进行超排处理一次，每次能获得可用胚胎,4-5,枚，一头良种母牛每年能生产可用胚胎,25-30,枚，移植到受体内能获得,12-15,头,犊牛，而,在自然状态下，一头母牛平均每年只能获得一头犊牛。,JIVET,技术简介,JIVET,：,juvenile in vitro embryo transfer,幼畜胚胎体外生产与移植,激素诱导后的犊牛卵巢,充分利用优良母畜的遗传资源,(,多,),缩短世代间隔，加快育种进程（快）,2.,加速育种进程,MOET,技术能大幅度提高母畜繁殖力，扩大优秀母畜在群体中的影响，增加后代选择强度。,如在奶牛育种中，,MOET,技术能,获得更多具有高产性能的半同胞和全同胞，在较短的时间内达到后裔测定所要求后代的数量，,提早完成后裔测定工作，增加选择强度和准确性，缩短育种进程。,应用,MOET,核心群育种方案，公牛的遗传评定时间可,缩短,40,，,生产性状的年遗传进展比常规的人工授精提高,20,左右。,如果在青年母牛或母羊中应用活体采卵和胚胎移植技术，年遗传进展可,提高,30,-70,。,3.,简化良种引进方法,活畜引进,不仅价格高、运输不便、检疫和隔离程序复杂，而且还存在风土驯化的问题。,胚胎移植与胚胎冷冻,技术相结合后，良种的引进可简化为冷冻胚胎的引进，不仅运输方便、检疫程序简单、成本低廉，而且后代对引种地生态环境适应性和抗病力增强。,目前，牛羊胚胎移植与冷冻技术已成为国际、地区间良种遗传资源交流廉价而简便的方式。,4.,保存品种资源,结合,胚胎冷冻技术,为可保存国家或地区间特有的家畜品种资源，建立种质资源库提供新的技术手段，还可,降低种质资源保存费用,。活畜保种不仅成本很高、规模有限，而且还容易发生基因漂变。胚胎冷冻保种也优于精液冷冻保种，因为一个胚胎是一个完整的个体，这样，冷冻或冷藏一个胚胎不仅保存了一个个体的基因，也保存了基因组织。,而且要从精子中重新构建一个已经灭迹了的群体，需要级进许多世代，而通过胚胎再构建一个群体，仅在一个世代内即可实现。,胚胎冷冻保种不仅,成本低廉、方法简单,，而且能,避免活畜保种因疾病、自然灾害或基因漂变造成种质消亡,的风险。,5.,诱发单胎动物产双胎,性别控制,避免异性孪生不育症,6.,研究手段,目前，胚胎工程技术中应用最多的是胚胎移植技术，无论是转基因胚胎还是克隆等获得的胚胎，最后都必须经胚胎移植才能获得后代，胚胎移植是,胚胎工程的最后一道,“,工序,”,。,因此，可以说它是,胚胎工程技术的基础。,胚胎移植技术与其他繁育技术的关系,胚胎移植技术在整个动物繁育新技术的体系中是一项基础性的、关键的技术,人工授精,核移植技术,发情控制与超数排卵技术,胚胎移植,干细胞技术,胚胎采集、鉴定与冷冻保存技术,胚胎分割技术,卵子体外成熟，体外受精,嵌合体技术,三、国内外发展概况,1.,背景,胚胎移植技术是,20,世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。,1951,年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛。,1976,年，牛非手术法胚胎移植获得成功。,国际间胚胎贸易非常活跃，早在,1994,年，全世界仅胚胎移植牛就已超过,350,000,头，其中进出口的胚胎约占总数的,10%,。,近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。,流动实验车（新疆）,2.,发展前景,我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。,农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；,胚胎移植技术作为扩大良种牲畜数量的一种最好手段，将在畜牧业生产中起到越来越大的作用，胚胎移植技术产业化前景十分广阔。,四、胚胎移植的基本原则,移植前后所处的环境应是相同或,相似的,移植的时间要适宜,胚胎的发育应当正常,供体和受体在,种属,上必须一致；,供体和受体在,生理,上必须一致：供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过,24h,，否则移植成功率显著下降；,从供体中收集胚胎的,部位,与给受体移植胚胎的部位必须一致：即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。,1.,移植前后所处的环境应是相同或相似的,Follicular(egg)development,hormonal changes,endometrial(uterine lining)changes,胚胎收集与移植的时间,不能超过周期黄体的寿命,，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第,7,天，最好是在发情配种后的,第,5-7,天,内进行。,2.,移植的时间要适宜,胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。,同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。,3.,胚胎的发育应当正常,五、牛胚胎移植操作步骤,供、受体牛的选择,供体的超数排卵与人工授精,受体的同期发情,胚胎的收集,胚胎的检查和评定,胚胎的移植,1.,供、受体的选择,供体应是,良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体；,供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳；,供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，,超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。,1.1,供体母畜的选择,一般选用,价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；,要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同；,应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，,移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。,1.,2,受体母畜的选择,2.1,超排定义,在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称,“,超排,”,。,2.,供体的超数排卵与人工授精,牛有,PG,法和,CIDA,法两种；,发情后,9,13,天开始；,常用的激素为,FSH,；注射方法一般是连续,4d,递减注射,每天,2,次,间隔,12,小时（半衰期短）,；,发情后,8,12,小时配种，间隔,12,小时再配种一次。,2.2,超数排卵方法,在发情周期第,10,、,11,、,12,、,13,天每头牛分别肌注,FSH 160,、,140,、,110,、,90,单位（共,500IU),，每天分两次注射，在第,12,天注射,FSH,的同时肌注,PG,，上午,2,支,/,头，下午,1,支,/,头。,发情后供体,AI,或配种,2,-,3,次。,供体牛的超排方案,3.,受体的同期发情,3.1,定义,利用某些外源激素,人为控制,并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称,同步发情,。,缩短黄体期的前列腺素法,(PG,法,),延长黄体期的孕酮法,3.2,同期发情方法,PGF,2,有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效。,在情期第,9,天以后，注射,PGF,2,，常可在注射后,2-3,天内发情,(WHY?),。,对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔,10-12,天的两次注射法。,此方法方便可靠，但费用较高。,为何要进行两次注射？,3.2.1,前列腺素处理法,s,母牛发情周期,第,7-17,天，对前列腺素（,PG,）有反应,孕酮能够抑制腺垂体释放,FSH,，每日肌注或口服孕酮，或经,阴道海绵栓给予孕酮或其类似物,，一般处理,12-18,天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，通常在,2-3,天内发情。,为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，可以给予小剂量的,FSH,。,此法费用低，但处理时间长。,3.2.2,孕激素处理法,4.1,冲卵液和保存液的制作,冲卵液有很多种，目前最常用的为含,5%,犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（,D-PBS,），也可用于体外短期保存胚胎。,保存时间长或体外培养多用,M-199,液。,4.,胚胎的收集,4.2,回收过程,牛,适宜于,5-7,日龄,胚胎,;,现均采用,二通管非手术采卵法：,用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气孔注入,8-10ml,空气,抽出探针，通过中心管道反复注入,-,回收冲卵液,连续,5-6,次。同样方法冲另一侧子宫角。,PBS,集卵杯,子宫颈,子宫角,卵巢,牛的非手术法回收胚胎,a.,冲卵液,b.,硬膜外麻醉,c.,插入子宫中的,Foley,管,d.,子宫颈,子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行,检卵,；,胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。,5.,胚胎的检查和评定,A,级,;,形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,透明带适中；,B,级,;,轮廓清晰,色调和细胞密度良好；,C,级,;,轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多；,D,级,;,轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液泡很多。,5.1,胚胎的分级标准,5.2,不同发育阶段的正常胚胎,5.3,未受精卵或异常胚胎,2-cell,4-cell,8-cell,16-cell,Morula,Blastocyst,5.4,正常胚胎的形态,6.,胚胎的移植,重点应检查,子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛,，并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。,牛站立保定于六柱栏保定架内，用,2%,盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用,18,号针头，每只牛约,5ml,。,1.,受体母牛的准备,1.1ml,注射器,2.,装管接头,3.,细管,A.,棉塞,B.,气泡,、,、保护液,.,含胚段,装管器械和装管方法,2.,胚胎的移植方法,直肠把握法,2003,年,9,月,4,日降生的良种胚胎移植牛,（江苏省农业三项工程项目）,受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛,（江苏省农业三项工程项目）,外国专家来访,外国专家来访,六、山羊胚胎移植概述,山羊胚胎移植产业化,1.1,超排方案,超排方案,1(FSH+PG,法,),：,从供体发情周期的第,9-13,天开始注射,FSH,，以日递减剂量连续注射,3,天,6,次，每次间隔,12,小时,总剂量为,150-300IU,，在第,5,次注射,FSH,的同时肌注氯前列稀醇,0.1,毫克。,1.,供体的超数排卵技术,超排方案,2(CIDR+FSH+PG,法,),：,在发情周期的任何一天给供体阴道内放入,CIDR,，计为,0,天，然后于第,9-13,天任何一天开始肌注,FSH,，递减法连续注射,3,天共,6,次，在第,5,次肌注,FSH,时取出,CIDR,，并肌注氯前列稀醇,0.1,毫克，一般在取出,CIDR,后,24-48,小时发情。,2.,胚胎的回收,场所、器械和人员的准备,供体羊的术前准备：,术前,1,日停止喂食但不停水；术部剃毛；麻醉现多用速眠新处理；术部皮肤先用,2%-4%,的碘酒消毒，晾干后再用,70%-75%,的酒精棉涂擦脱碘。将创巾固定在术部周围并露出术部。,2.1,术前准备,2.2,手术过程,皮肤用外科刀一次切开，,4,6,厘米。肌肉用钝性分离的方法沿肌纤维的走向分层切开，最后切开腹膜。注意及时止血。,手术者将食指及中指由切口伸入腹腔触摸子宫角，用二指夹持，因势利导地牵引至创口表面，先循一侧的子宫角至该侧的输卵管，在输卵管的末端弯转处找到该侧的卵巢，观察卵巢表面的排卵点和卵泡发育情况并做记录。,2.3,冲洗输卵管法,适宜于,2-3,日龄,的胚胎。,将一根长,5-7cm,，外径,3-4mm,的硅胶管插入输卵管喇叭口内,1-1.5cm,，用血管夹或手固定固定。以左手母指和食指捏住子宫角前端，右手持吸有冲卵液的针管并将针头插入子宫角尖端，注入冲卵液约,10,15ml,。,输卵管回收胚胎示意图,供体的冲胚,2.4,冲洗子宫法,适宜于,5-7,日龄胚胎。,子宫角回收胚胎示意图,(1),子宫角回收胚胎示意图,(2),用作受体的母畜应具有明显的发情症状，发情时间应与供体母畜一致。,羊采用,手术法移植,。,受、供体同时做好术前准备，在进行胚胎检查的同时或之后，立即在受体母畜腹部做一切口，轻轻拉出子宫角，找到排卵侧的卵巢并观察黄体数量与发育情况。,3.,胚胎的移植,只有黄体发育良好的受体才能用于胚胎移植，黄体过小、发育异常或退化的受体都不能用于胚胎移植，否则很难受孕。,卵巢上有,1,个黄体的受体一般只给移,1,枚胚胎，有,2,个或,2,个以上黄体者可以移,2,枚胚胎。,根据胚胎的发育阶段以及回收与移植部位一致的原则，用移植管将胚胎注入黄体同侧子宫角前端或通过喇叭口,送至输卵管壶腹部,（如图），然后迅速复位、缝合。,注意：,保护受体卵巢黄体,。,山羊手术法移胚,A.,子宫移胚器,B.,子宫角移胚,C.,输卵管移胚,1.,移植针,2.,硅胶管,3.,吸有胚胎的细管,麻醉、固定,刮 毛,消毒,供体的手术,超排后的黄体,非正常的卵巢：大卵泡,供体的冲胚,检 胚,移植胚胎,缝 合,供体受体的解麻,受体与产的羔羊,肉羊基地与胚胎移植产业化,扬中市种羊场 如东县种羊场,睢宁波尔种羊场 丰县合作种羊场,苏州湖羊种羊场 东台新街种羊场,常州新世纪农业 萧县恒发牧业公司,睢宁南非波尔种羊场 如皋天顺恒牧业公司,南京农业大学,动物胚胎工程技术中心,2002,年,8,月,5,日，时任江苏省省委书记的回良玉副总理视察睢宁基地,睢宁波尔种羊场。,南京农业大学动物胚胎工程技术中心常州,基地,本章小结,重点,胚胎移植步骤,胚胎移植意义,难点,手术法移植和非手术法移植,思考题,胚胎移植的意义,胚胎移植的生理基础,羊的手术法移植,谢谢,!,