新型诊断技术和应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,新型诊断技术与应用,主要技术,Realtime-PCR,差异显示,PCR,RFLP,PCR-SSCP,FISH,基因芯片,一、定量,PCR,对,DNA,或,RNA,样本的靶序列进行定量分析。,主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等,在定量,PCR,反应体系中，除了常规,PCR,反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。,内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是,-肌球蛋白基因,荧光定量,PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），,又称实时,PCR，,是目前较精确的进行定量检测,PCR,的方法,FQ-PCR,通过荧光信号对,PCR,过程中产物量进行实时监测，,精确计算出,PCR,的初始模板量,荧光信号的检测方法：,1、,DNA,结合染料技术,2、水解探针技术（,TaqMan probe）,技术,3、杂交探针技术,5,3,5,3,TaqMan,TM,Extension Step,5,3,1.,Strand Displacement,Taq,3,Q,R,5,5,3,3,Q,Taq,R,5,2.,Cleavage,3.,Polymerization,Complete,5,3,Q,Taq,R,3,5,4.,Detection,5,3,3,Q,Taq,R,5,l,R,5,3,R,Q,实时定量,RT-PCR,检测,CEA,基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用,CEA,基因在消化系统上皮腺癌，,尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，,因此在肿瘤细胞内可检测到其转,录本，而在正常成人体内极少表,达。,正常成人体内,CEA,基因表达,胃肠癌肿瘤组织中,CEA,基因的表达,在肿瘤发生血道转移时，外周血,中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、,特异的技术检测到这些肿瘤细胞,中,CEA,基因的转录本，是发现肿,瘤早期转移的关键。,胃肠癌患者外周血中,CEA,基因的表达,二、差异显示,PCR（differential display PCR,DD-PCR）,一种以逆转录,PCR,为基础的研究基因表达差异的技术。,DD-PCR,主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。,差异显示,RT-PCR(Differential display RT-PCR),三、,PCR-RFLP,利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使,PCR,产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。,RFLP,RFLP,诊断镰状细胞贫血,四、,PCR-SSCP,-Single Strand Conformation Polymorphism,单链,DNA,分子具有特定的二级空间构象，取决于,该分子本身的碱基组成。突变,DNA,的,PCR,产物经,变性后产生与正常,DNA,空间构象不同的两条单链,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的,单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正,常与突变的,DNA,不同顺序 不同构象 不同电泳行为,PCR-SSCP,的应用,1.,基因点突变的监测,2.,多态性检测,3.外显子的筛查,4.,cDNA,筛查,PCR-SSCP,与,RFLP,比较,无需特殊的限制性内切酶作用,可测出理论上任何一个碱基突变位点,操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂,电泳条件的 改变容易影响,SSCP,五、,PCR,产物的序列分析,（,DNA sequencing）,主要见于分子克隆时对于目的基因扩,增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时,分析扩增片段中点突变的位置和性质。,可将产物纯化后作为模板直接测序，,也可将,PCR,产物克隆入载体后再测序，后,者测序的效果更好，常用,T-A,克隆。,Sanger,测序技术：,以待测序列的单链,DNA,作为模板，加入一个引物和,dNTP,作为底物，并加入一定比例的2，3-,ddNTP，,在,DNA,聚合酶的作用过程中，正常,dNTP,的掺入使链延伸，若,ddNTP,的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种,ddNTP,结尾的,DNA,片段，经电泳后可直接读出碱基序列。,PCR,测序演示版,1,2,PCR,技术在分子诊断中的应用,PCR,技术在分子诊断中的应用,感染性疾病中病原微生物核酸的检测,单基因遗传性疾病的基因诊断,多基因病相关基因的检测,肿瘤相关基因的检测,移植配型和法医学上的应用,一、感染性疾病的分子诊断,定性或定量检测致病微生物的核酸，,已经用于病毒、细菌和寄生虫感染,的诊断。,动态、定量地检测病原体核酸能对,疗效判断和病情预后提供客观的依,据。,SARS,相关冠状病毒的分子诊断,2003年4月，香港研究者,Peiris,等报,告了50 例,SARS,病人的临床表现和,病毒学研究结果证明，新冠状病毒,可能是,SARS,的致病原因。,（,Lancet,2003,361:9365),其它实验室陆续得出相同结论。,2003年4月，德国汉堡,Bernhard-,Nocht,热带医学研究所学者,Drosten,等用随机扩增技术，获得长度为,300,bp,的核苷酸序列。,根据这段序列，建立了检测新冠状,病毒的常规和实时定量,PCR,技术。,（,.org,on April 10,2003）,引物和探针,BNIoutS2-BNIoutAs,BNI-1,片段，189,bp,BNIinS-BNIinAs,BNI-1,片段的内套片段，108,bp,BNITMSARS1BNITMSARAs2,BNITMSARP(,荧光素标记的探针）,产物长度：77,bp,检测标本,痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺,泡灌洗液、血浆、粪便。,检测方法,1.逆转录-巢式,PCR,2.,逆转录-实时,PCR,结 果,病人和接触者（具临床症状）的痰,液中用外套引物检测到了病毒。,病人的其它标本用套式,PCR,检测到,病毒。,有报道显示，在可能,SARS,病人,中，病毒的检出率为100%。,在疑似,SARS,病人中的检出率为,23%。,所有健康接触者中未检测到病毒。,检测病毒的3种方 法（血清学检测、,病毒分离、,PCR,技术）中，,PCR,技,术的检出率最高。,疾病的早期即可获得阳性结果（早,于血清转换期）。,特异性较高（,SARS,患者中的阳性,率约为80%，对照中的阴性率约为,98%100%）。,现有的方法敏感性较差，阴性结果,不能排除病毒感染。,其他感染性疾病的诊断,HBV,病毒,HIV,病毒,.,二、单基因疾病的诊断,单基因遗传病是由于某一基因结,构的变化或由其而引起的基因表,达异常所导致的疾病，因此用分,子生物学技术检测致病基因的遗,传缺陷是诊断这些疾病最根本的,手段。,2、,DMD,的分子诊断,X,染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率,为,1/3 500,个男孩,DMD,基因位于,Xp21.2-21.3,，全长,2500,Kb,DMD,基因的突变导致,dystrophin,缺陷,检测,DMD,基因的技术：,Southern,印迹、,PCR-SSCP,DMD,的基因检测,是一种高发病率、高致残、高致死的,X,染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。,致病基因,DMD,的全长为250,kb，,有79个外,显子。,DMD,的最主要遗传缺陷是外显子缺失，,约占60%70%。,DMD,基因外显子缺失的检测,PCR-SSCP检测非缺失型DMD,C,母,子,肢带型肌营养不良(,limb-girdle muscular dystrophy,LGMD）,是一组累及肩胛、骨盆带,和四肢近端肌肉的遗传性疾病。,LGMD1：,显性遗传（1,A、1B、1C）,LGMD2：,隐性遗传（2,A2H）,不同类型的,LGMD,不仅在遗传学上具高度异质,性（不同致病基因，不同基因突变），临床表,现亦十分不一致，临床诊断和分类十分困难。,LGMD2B,的基因定位和遗传缺陷的研究,诊断标准：,LGMD,的诊断必须符合以下2个标准之一：,1.致病基因与已知的某一,LGMD,基因位点,连锁,2.检测到致病基因编码产物的缺陷,先证者,男性，,56,岁。,初中时发觉体育活动受限，且无法踮脚站立。,以后症状逐渐加重，并伴有下肢肌肉萎缩。四,年前来我院就诊时已无法行走，四肢肌肉萎缩,明显，尤以双侧小腿为甚。肌电图示肌源性损,害，,CK,值,3,倍高于正常范围。,家系资料,致病基因编码产物检测结果,先证者,LGMD2B,基因的编码蛋白,dysferlin,条带密度与正常对照相比有明显下降，其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变。,免疫荧光检测骨骼肌dysferlin,C P,DYSF,基因突变的检测,在,DYSF,基因的突变热点区筛查，以期,找出导致,dysferlin,缺陷的基因突变。,逆转录,PCR,产物作序列分析,G,DYSF,基因检测结果,cDNA,第6425/6426位(52号外显子)缺失,1个,G,碱基(6425/6426,del G)。,第2019位密码子,agg agc，,下游读码,发生移码突变，使第2035位密码子,atg,tga(53,号外显子，,M 2035 X)。,终止密码的提前产生是,dysferlin,缺陷的,原因。,是尚未报道的一个新突变，也是中国第,一例,DYSF,基因突变。,根据患者病史、体征和分子诊断实验结,果，这是一个由于,DYSF,基因突变造成,相应编码产物缺陷而导致的疾病。,三、多基因病的分子诊断,多基因病具一定的遗传因素，家庭,发病率高于人群发病率，但是疾病,的产生都以一定的环境条件为诱因，,遗传因素在其中所起作用程度各异。,多基因病中的遗传因素是若干个,易感基因微小作用的累加，某一,易感基因结构的变化不足以导致,疾病的产生。,人类基因组多态性是多基因病基因,诊断的基础，易感基因多态性的检,测能帮助我们理解多基因病发生的,机制，有助于对疾病的诊断和分类。,高血压候选基因多态性分析的应用前景,临床分型,靶器官损伤,个体化治疗,基因多态性与盐敏感性高血压,-内收素 血管紧张素转换酶,上皮钠通道血管紧张素原,心钠素2肾上腺素能受体,SAG,蛋白亚单位3,ACE,基因多态性与高血压靶器官损伤,疾病 研究报告数,I D D D,冠心病 30 +11%+32%,心肌梗死 15 +12%+39%,脑卒中 5 +22%+94%,高血压肾病 19 +10%+53%,糖尿病肾病 11 +40%+56%,*,与,II,型相比，,DD,型和,ID,型发生上述疾病的危险性增高程度,(145个,ACE,基因,I/D,多态性研究49959例的荟萃分析）,基因多态性与高血压靶器官损伤,脑卒中,载脂蛋白,E,-,纤维蛋白原,血管紧张素原,血管紧张素,II,的1型受体,内皮型一氧化氮合酶,心钠素,冠心病,副氧酶,凝血因子,V,凝血因子,VII,载脂蛋白,B,TOHP,试验中的,AGT,基因研究,目的,：,观察,AGT,基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的,血压变化和高血压发病率间的关系,对象,：,1509例,基因分析,：,AGT,基因,G-A,多态性,结果,：,三年后高血压发生率（%）,对照组 限盐组 减轻体重组,AA,型 45 28 25,GG,型 32 41 32,Hunt SC,et al:Hypertension,1998;32:393-401,基因多态性分析指导抗高血压药物的选择,药物种类 基因,利尿剂,-内收素,ACE,抑制剂,ACE、AT1,-,受体阻滞剂,G,蛋白（,Gs),六、,FISH,FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using Flyorescene microscopy.,七、生物芯片,生物芯片技术在今后的多基因病的的发病机制研究、诊断和治疗等方面将发挥越来越显著的作用,谢谢 圣诞快乐,