食品微生物学检验.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017-5-10,#,食品安全国家标准食品微生物学检验,1,、总则,2,、菌落总数,3,、霉菌、酵母菌,4,、大肠菌群,5,、沙门氏菌,6,、金黄色葡萄球菌,7,、培养基性能测试,8,、食品微生物检测试验室质量控制,总则,GB4789.1-2016,1.,范围,：,规定了食品微生物学检验的基本原则和,要求，本标准适用于食品,微生物学,检验,2.,实验室,基本,要求,2.1,检验人员,：,相应的微生物专业或培训经历，具有相应的资质，能够理解并 正确实施检验。（通过,内部质量控制和,能力验证、或,使用标准菌株等方法客观评估人员的,能力。）,2.2,环境,与,设施：,实验室环境不影响检验结果的准确性，实验室内的温度、湿度、洁净度、照度、噪声应符合工作,要求（参考,GB/T 27405,2008,附录,）,2.2.1,无菌室内光照应分布均匀，工作台面的光照度应不低于,540 lx,。,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,2.2.2,无菌室应具备适当的通风和温度调节的条件。无菌室的推荐温度为,20 ,，相对湿 度为,40,60%,。,2.2.3,一般样品检验应在洁净区域（包括超净工作台或洁净实验室）进行，洁,净区域应有明显的标示。,2.2.4,病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（柜）进行。依据,GB 19489,2008,实验室生物安全通用要求,2.2.5,制定合理的环境监测程序与频次,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,2.2.6,无菌室的管理,2.2.6.1,无菌室在使用前后应进行有效消毒。,2.2.6.2,无菌室的灭菌效果应至少每周验证两次,2.2.6.3,应制定清洁、消毒、灭菌、使用、和应急处理程序,2.2.6.4,应记录环境监测结果,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,2.3,实验设备,2.3.1,实验室应制定并实施设备的维护、校准、和性能验证的程序。每台设备都要有唯一的标识。,2.3.2,应,定期,验证和维护设备，应根据使用频率在特定的时间间隔内进行维护和相关性能验证,2.3.3,试验设备应有日常的,监控,记录和使用记录,GB/T27405-2008,设备校准要求和频率,设备类型 要求 推荐频率,设备类型 要求 推荐频率,设备类型 要求 推荐频率,温控设备（培养箱、水浴、冰箱等）、干热,/,高压灭菌器,温度稳定和均匀性。,两年一次和维修后,监测温度,每日或每次使用前,天平,清零并校准,每日或每次使用前,移液器（管）,准确性和精密度,按使用频率,生物安全柜,确定性能,一年一次和维修后,微生物监测,每两周,气流监测,每次使用前,无菌室或洁净室,监测空气和表面微生物,每两周一次,超净工作台,确定性能,初次使用前和维修后,用无菌平板监测,每两周一次,GB/T27405-2008,设备清洁、维护的要求和频率,设备类型,要求,建议频率,培养箱、灭菌想、冰箱,清洁和消毒内表面,每月一次,高压灭菌器,检修,按生产商推荐有规律进行,清洁和消毒,每年一次货按生产商推荐,压力容器的安全检查,每年,实验室,清洁和消毒工作区表面,每个工作日一次及使用期间,清洁地板,每周一次,清洁和消毒其他表面,每三个月一次,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,2.4,检验用品,2.4.1,保证灭菌效果，灭菌与未灭菌的用品分开存放并有明确标识。灭菌检验用品应记录灭菌的温度与持续时间及有效使用期限。,2.5,培养基,和,试剂的制备和质量要求按照,GB4789.28-2013,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,2.6,质控菌株,2.6.1,实验室应保存能满足试验需要的标准菌株,2.6.2,应使用微生物菌种保藏专门或专业权威机构保存。可溯源的标准菌株,2.6.3,标准菌株的保存、传代按照,GB4789.28,的规定执行,2.6.4,对实验室分离菌株（野生菌株），经过鉴定后，可作为实验室内部质量控制菌株。,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,3.,样品的采集,3.1,采样原则,：无菌操作，应遵循随机性、代表性。,3.2,采样方案,3.2.1,根据采检样目的、食品的特点、批量、检验方法、微生物,的危害程度等确定采样方案。采样方案分为二级,n,、,c,、,m,和三,级采样方案,n,、,c,、,m,、,M,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,3.2.2,采集样品的标记，应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。,3.2.3,采集样品的贮存和运输,采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。,防止样品中的微生物发生变化。,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,3.3,各类食品的采样方案按食品的相关标准的规定执行：,3.3.1,预包装食品：应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，,每件样品的采样量应满足微生物指示检验的要求,3.3.2,散装食品或现场制作食品,4,生物安全与质量控制,4.1,质量控制：实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照、和空白对照,定期对检验过程进行质量控制。,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,4.2,实验室应定期对人员进行考核。,5,记录与报告,5.1,记录：检验过程中应即时、客观地,记录观察到的现象,、,结果,和,数据,等信息,5.2,报告：按照检验方法中规定的要求、,准确、客观的报告,检验结果,总则,GB4789.1-2016,实验室的基本要求,6,检验后样品的处理：,6.1,检验结果,报告后,，被检样品才能被处理,6.2,检出的致病菌的样品要经过,无害化,处理,6.3,检验结果报告后，剩余样品和同批产品,不进行微生物项目的复检,。,GB4789.2-2016,菌落总数测定,1,、菌落总数的定义,:,食品检样经过处理，在一定条件下,培养,后，所得 每,g,（,ml),检样中形成的微生物,菌落总数,2,、老师建议使用磷酸盐缓冲液。,3,、菌落计数,a,选取菌落数在,30300CFU,之间、无,蔓延,菌落生长的平板计数菌落总数。,b,、低于,30CFU,的平板记录具体菌落数，大于,300CFU,的记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。,菌落链,琼脂表面水膜,皿底水膜,GB4789.2-2016,菌落,总数测定,c,、其中一个平板有较大片装菌落生长时，而应以无片装,菌落,生长的平板作为该稀释度的菌落总数，若片装菌落不到,平板的,一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个,平板后,乘以,2,，代表一个平板菌落数。,d,、当,平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单,链作为,一个菌落计数。,GB4789.2-2016,菌落总数测定,4,、结果,与,报告,a,、,若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值,b,、,若有两个连续的稀释度平板上菌落数在适宜的计数范围内按公式计算,c,、,若所有稀释度的平板上菌落数均大于,300CFU,，则对稀释度,最高,的平板计数，其他平板科记录多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。,GB4789.2-2016,菌落总数测定,d,、,若所有稀释度的平板上菌落数均小于,30CFU,，则对稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算,。,e,、,若所有稀释度（包括液体样品原液）平板上无菌落生长，则以小于,1,乘以最低稀释倍数计算。,f,、,若所有稀释度的平板上菌落数均不在,30CFU300CFU,之间，其中一部分小于,30CFU,或大于,300CFU,时，则以最接近,30CFU,或,300CFU,的平板菌落数乘以稀释倍数计算。,GB4789.2-2016,菌落,总数测定,菌数,报告,规则,示列,各,稀释级（供试液,1ml/,皿）平均菌落计数,结果报告,CFU/g,原液,0.1,0.01,0.001,1,64,8,2,6.4,10,2,2,232.234,33,35,3.4,10,3,3,多不可计,325,42,4.2,10,4,4,321,28,2.810,4,5,0,0,0,10,6,0,0,0,1,GB4789.15-2016,霉菌和酵母菌计数,1.,范围：本标准规定了食品中霉菌、酵母菌的计数方法,本标准第一法适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数，,第二发适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数,2.,设备和材料,2.1,将均质器的名称具体为拍击式均质器或均质袋,2.2,无菌试管的修订,10,*,75mm,改为,18,*,180mm,2.3,删除了冰箱和恒温震荡仪增加了、,恒温水浴,、,旋涡混合仪（反复的吸吹）,GB4789.15-2016,霉菌和酵母菌计数,3.,培养基：生理盐水、磷酸盐缓冲液、孟加拉红和马铃薯,-,葡 萄糖,-,琼脂培,养基、灭菌温度的改变，倾注平皿量的改变，,4.,培养：正置培养,5.,菌落计数,5.1,选取菌落数在,10150CFU,之间，根据菌落形态,分别,计数霉菌和酵母菌菌落数,6.,报告,6.1,菌落数按四舍五入原则修约，菌落数在,10,以内时，采用一位数字报告，在,10100,之间，采用两位数字报告,6.2,菌落数大于或等于,100,时前三位数字采用四舍五入原则修约后取前两位数字后面用,0,代替位数来表示结果；也可以用,10,的指数形式来表示,GB4789.15-2016,霉菌和酵母菌计数,GB4789.15-2016,霉菌,和酵母菌计数,6.3,如空白对照平板长有菌落出现，此次结果无效,6.4,以,CFU/g,或,CFU/ml,为单位报告，报告或分别报告霉菌和,/,或酵,母菌数霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延！,多不可计,？,GB4789.3-2016,大肠菌群计数,1.,范围,1.1,本标准第一法（,MPN,）法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群,的计数,1.2,第二法（平板计数法）适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数,2.,设备,3.,培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨，煌绿乳糖胆盐，结晶紫中性,红胆盐琼脂，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水,。,4,、,第一法（,MPN,）法,4.1,样品稀释,4.2,样品匀液的,pH,值应在,6.57.5,之间,4.3,从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超,15min,4.4,初发酵试验：,24h,观察一次，未产气在培养至,48h,GB4789.3-2016,大肠菌群计数,4.5,复发酵试验（证实试验）,用接种环从产气的,LST,肉汤管中分别取培养物,1,环，移种于与煌绿乳糖胆盐,肉汤培养基中,36,+,1,培养,48h,+,2h,，观察产气情况，产气者为计为,大肠菌群阳性管。,GB4789.3-2016,大肠菌群计数,GB4789.3-2016,大肠,菌群,计数,5.,第二法平板计数：,5.1,平板菌落数的选择：,选取菌落,数在,10150CFU,之间,的,平板，,分别,计数上面可疑和典型的大肠菌群菌落，典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，最低稀释度平板低于,15CFU,的记录具体菌落数。,5.2,证实试验：从,VRBA,上挑取,10,个不同类型的,典型,和,可疑,菌落，少于,10,个菌落的全部挑取。,5.3,大肠菌群平板计数报告：经最后证实为大肠菌群阳性管数的试管比例乘以平板,菌落数，再乘以稀释倍数，即为每,g/ml,样品中大肠菌群数。,若所有稀释度上都无菌落生长，则以小于,1,乘以最低稀释倍数计算。,国标号,2003,版,2016,版,培养基,乳糖胆盐发酵管,伊红美蓝平板,乳糖发酵管,LST,发酵管,BGLB,发酵管,证实试验,分离培养基,证实试验,革兰氏染色,复发酵试验,仅进行复发酵试验,单位报告,MPN/100ml(g),MPN/ml(g),GB4789.3-2016,和,GB4789.3-2003,大肠菌群,MPN,法的区别,大肠菌群,MPN,检索表（,2010,和,2016,）,4789.4-2016,沙门氏菌,沙门氏菌属：肠杆菌科，沙门菌属，分类最复杂，,1,个属，,2,个种，,7,个亚,种，,2659,多血清型。血清型别复杂抗原变异多样，菌型鉴定和结果判定困,难。是重要 的肠道致病菌，能引起各种脊椎动物的肠道感染。,生物学性状：需氧和兼性厌氧，生长温度,10-42,最适温度,35-37,，适宜,pH,值,6.8-7.8,沙门氏菌是引起人畜共患食源性病源菌，广泛分布于自然界中，对禽类、生猪及其鲜肉制品的感染率最高，蛋类、禽类肉制品和猪肉是人类感染沙门氏菌的主要渠道。沙门氏菌不耐热，,55 1h,、,60 15-30min,即被杀死。冷冻对沙门氏菌无杀灭作用，在,-25,低温环境中仍可存活,10,个月左右。,1.,范围,1.1,本标准适用于食品沙门氏菌的检验并规定了沙门氏菌的检验方法,2,设备和材料,2.1,增加了,60mm,直径的平皿,3.,培养基和试剂,4,操作步骤,4.1,预增菌：,pH,值应在,6.8,+,0.2,用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力,4.2,选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其他细菌收到抑制,4.2.1TTB,样品中沙门氏菌量少，可选择性抑制大肠菌群，提高目的菌的分离,4789.4-2016,沙门氏菌,4.2.2SC,：可以抑制粪便中链球菌和大肠菌群使沙门顺利繁殖,4.3,分离,:,轻轻,摇动培养过的样品混合物。用直径,3mm,的接种环,4.3.1BS,：培养基不含乳糖，是分离沙门氏菌的首先培养基,注意事项：,BS,不能高压灭菌，溶解不能过热，只能在使用前一天配制，保存与冷 暗处，,48h,失效,XLD,：不高压，溶解时不能过热,TSI,：应制成高柱斜面，保证底部形成厌氧环境；试管冒不可太严，氧气供应不好可使斜 面丧失碱性环境,4789.4-2016,沙门氏菌,4789.4-2016,沙门氏菌,选择性琼脂平板,BS,琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变,HE,琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎黑色,XLD,琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。,沙门氏菌属显色培养基：按照显色培养基的说明进行规定。,4.4,生化试验,4.4.1,从选择性琼脂平板上分别挑取,2,个以上典型,或,可疑菌落，接种,TSI,琼脂，先在,斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基,和,营养琼脂平板，,置,361,培养,18h,24h,，在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验,培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表,4789.4-2016,沙门氏菌,三糖铁琼脂,赖氨酸,脱羧酶试验培养基,初步判断,K,A,（）,（）,+,可疑沙门氏菌属,K,A,（）,（）,-,可疑沙门氏菌属,A,A,（）,（）,+,可疑沙门氏菌属,A,A,/,/,-,非沙门氏菌,K,K,/,/,/,非沙门氏菌,K,A,（）,（）,/,非沙门氏菌,注：,K,：产碱，,A,：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；,/,：阳性或阴性。,4789.4-2016,沙门氏菌,4.4.2,硫化氢、靛基质、,Ph7.2,尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、会有三种情况。,4.5,血清学鉴定,4.5.1,检查培养基有无自凝性,4.5.2,多价菌体抗原鉴定,4.5.3,多价鞭毛抗原鉴定,4789.4-2016,沙门氏菌,4.6,血清学分型,4.6.1 O,抗原的鉴定,4.6.2H,抗原的鉴定,4.6.3Vi,抗原的鉴定,4.6.4,菌型的判定,4.7,综合以上生化试验和血清学鉴定的结果报告,25g/ml,样品中检出或未检出沙门氏菌,4789.4-2016,沙门氏菌,1,、,范围：本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。,本标准第一法适（定性）用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验,;,第二法（平板计数法）适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数,第三法（,MPN,法）适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数。,4789.10-2016,金黄色葡萄球菌,2,、设备和材料,2.1,恒温水浴箱,:3656,替代,（,3765,）,2.2,涂布棒代替了注射器,3,、培养基,3.1,只有,7.5%,氯化钠肉汤删掉了,10%,氯化钠胰酪胨大豆肉汤,4,检验程序,4789.10-2016,金黄色葡萄球菌,4.1,第一法金黄色葡萄球菌定性试验,4.1.1,样品处理,4.1.2,增菌,4.1.3,分离：,Baird-Parker,平板,361,培养,24h48h,。旧国标（,18h24h,或,45h48h,）,4789.10-2016,金黄色葡萄球菌,2010,版,2016,版,鉴定：,1,、染色镜检,2,、血浆凝固酶试验,挑取,Baird-Parker,平板或血平板上可疑菌落,1,个分别接种到,5mLBHI,和营养琼脂小斜面,361,培养,18h24h,。取新鲜配制兔血浆,0.5mL,放入小试管中,再加入,BHI,培养物,0.2mL0.3mL,振荡摇匀,置,361,温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察,6h,如呈现凝固,(,即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块,),或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到,5mLBHI,361,培养,18h48h,重复试验。,初步鉴定：,金黄色葡萄球菌在,Baird-Parker,平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为,2mm3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色,(,非白色,),的边缘,周围绕以不透明圈,(,沉淀,),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色,(,有时为白色,),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。,确证鉴定：,1,、染色镜检,2,、血浆凝固酶试验,挑取,Baird-Parker,平板或血平板上至少,5,个可疑菌落,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,培养基的质控,入库登记记录,配制,记录,灭菌,记录,培养设备使用记录,菌种使用记录,名称、批号、接收数量、规格、接收日期、产品的有效期、产品的合格证明、包装的完整性、厂家、接收人等,配制量、配制步骤、配制人、干饭的使用量等,使用,记录,销毁记录,灭菌温度、时间、压力,灭菌人、,pH,值、,色泽、均匀度,和灭菌结果证明,使用日期、使用量、剩余量、,使用人等,菌种接收、传代、保存、使用、销毁等记录,培养箱、冰箱、,废弃物,培养基验收,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,一、修订依据：,ISO/TS 11133-1:2009,；,ISO/TS 11133-2:2003,；,二、范围：规定了食品微生物学检验用培养基的质量要求和控制,三、评估培养基整体性能的指标：,理化指标,微生物学指标：特定条件下培养基对测试菌株的反应,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,四、培养基分类及术语和定义,纯化学培养基：由已知分子结构和纯度的化学成分配制而成的培养基,固体培养基：在液体培养基中加入一些琼脂和凝胶，加热至,100C,溶解，冷却凝固后成固,体,状态培养基可以制成平板和斜面。,运输培养基：,保藏培养基：营养琼脂斜面,悬浮培养基：如磷酸盐缓冲液,复苏培养基：使微生物恢复正常生长能力,增菌培养基：给微生物繁殖提供特定的生长环境,选择性增菌培养基：允许特定的微生物在其中繁殖,非选择性增菌培养基：保证多种微生物能够生长的培养基,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,分离培养基：单独的支持微生物生长,选择性,分离培养基,：孟加拉红培养基，,XLD,。,非,选择性分离培养基,：对微生物没有选择性的抑制。,鉴定培养基：如 乳糖发酵管有特定的鉴定反应通常不需要进一 步确证试验的培养基,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,计数培养基：能够对微生物定量的选择性或非选择性培养基,确证培养基：如,BGLB,商品化即用型培养基：贮存条件、有效期和使用方法进行保存和使用。,商品化脱水合成培养基,:,实验室应有有效的,培养基目录清单,，清单应,包括,密闭性检查,、,首次开封日期,、,内容物的感官检查,。开封后的脱水,培养基应在配制前观察,粉末的流动性,、,均匀性,、,结块,、和,色泽,等变化。,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,试剂：用于微生物检验染色的染色试剂盒培养基配套试剂,测试,菌株：用于培养基性能测试的微生物,标准,菌株,：,主要从标准菌种保藏中心购买,标准,储备菌株：,储备,菌株：,工作,菌株：,五、贮存,：,一般要求，严格按照供应商的贮存条件、有效期和使用方法进行,培养,基,和试剂的保存和使用,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,六、培养基,在实验室制备中的注意事项：,1,、实验室自制的培养基，,2,至,8,度平板建议保存,2,周至,4,周。并标记上名称和配制日期、有效期。瓶装及试管培养基不超过,3,个月至,6,个月，培养基的贮存应在建立验证的有效期。主要观察培养基是否有颜色变化、,蒸发（脱水,）或,微生物生长,的情况，当培养基发生这类变化时，应禁止使用。,2,、配制记录应有：配制日期、配制量、灭菌条件和操作步骤、,pH,值,（应有记录体现灭菌后培养基的,pH,值，用氢氧化钠或盐酸）。,3,、水，电导率,25,度时不超过,25uS/cm,微生物不超过,10,3,CFU/ml,。,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,4,、分装,容器的体积应比培养基的体积最少大,20%,5,、,灭菌,：,湿热,高压灭菌（,pH,、色泽、灭菌效果、均匀度,）、过滤除菌、煮沸灭菌。,5.1,pH,测定和调整：室温,25,度标准值,+,0.2,范围内,5.2,过渡灭菌：未及时冷却或装载体积超过,1000ml,6,、培养基,的使用：溶化后放置时间不超过,4,个小时，在倾注培养基时不超过,15,分钟,七、微生物学要求：实验室使用商品化培养基和试剂时，应保留生产商提供的资,料并制定验收程序，如需验证应达到附录,E,质量控制的标准要求。,生长特性,一般要求：对每批成品培养基或试剂进行评价,定量法,、,半定量法,、,定性法,三种方法。,测试菌株：对不含指示剂或选择剂的培养基，只采用一株阳性菌测试，对含有指,示剂的培养基或试剂，应用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,生长率：按规定用适当的方法将测试菌株接种至固体、半固体和 液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应到达规定的最低限值,选择性：为定量评估培养基的选择性，应安照规定以适当的方法将适量,的测试菌株接种至选择性培养基，培养基的选择性应达到规定的限值,生理生化,特性（特异性）,：确定培养基的菌落形态学，鉴别特性和选择,性，以获得培养基的基本特性,性能评价和结果解释：若按照规定所有的测试菌株的性能测试达到标准，,则该批培养基的性能测试结果符合规定。,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,非选择性分离和计数固体培养基,选择性分离和计数固体培养基,非选择性增菌液体培养基,悬浮培养基和运输培养基,选择性增菌液体培养基,非选择性液体计数培养基,生产商及实验室自制培养基和试剂,实验室使用商品化培养基和试剂,定量法,定量及半定量法,半定量法,定性法,半定量法,定量法,1001000cfu,GB4789.28-2013,培养基和试剂的性能测试方法,一,：生产商及实验室自制培养基和试剂的质量控制的测试方法,二,：实验室使用商品化培养基和试剂的质量控制的测试,方法,2.1,非,选择性分离和计数固体培养基的半定量测试方法,2.1.1,平板,的制备与保存：平皿中形成,3mm,厚的琼脂层，使用前应对琼脂,表面,进行,干燥,。,2.1.2,将,标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜作为工作菌悬液。,2.1.3,接种,：用,1uL,接种环进行平板划线,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,11,13,15,14,16,目标菌半定量,划线的方式,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.1.4,计算,培养后，评价菌落的形状、大小和密度，计算生长指数,G,。,结果解释：,G,大于或等于,6,时，培养基可以接受。非选择性的培养基的,G,值,较高。,2.2,选择性,分离和计数固体培养基的半定量测试,方法,2.2.1,目标菌半定量测试方法：按,2.1,操作,2.2.2,非目标菌（选择性）半定量测试方法,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.2.1,平板的制备与保存,2.2.2,工作菌悬液的制备,2.2.3,接种：同时接种,2,个平板,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.2.4,计算：每条有生长稠密菌落生长的划线则,G,为,1,，如果仅有一半的线有稠密菌落生长的划线则为,0.5,，如果划线上没有菌落生长，生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则,G,为,0,。,结果解释：非目标菌生长指数,G,一般小于,1,，至少应达到小于,5.,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.3,非选择性增菌培养基、选择性增菌培养基、和选择性液体计数培养基的定,性测试,方法,2.3.1,培养基的制备：将培养基分装试管，每管,10ml,2.3.2,工作菌悬液的制备,将标准菌株接种到非选择性肉汤中过夜，进行,10,倍系列稀释至,10,-3,，,或制备成、,10,5,CFU/ml,10,7,CFU/ml,的菌悬液作为工作菌悬液。,10ml,9ml,9ml,9ml,9,ml,9ml,9ml,1ml,1,ml,1,ml,1,ml,1,ml,1,ml,2.3.3,用,1uL,接种环取,1,环工作菌悬液直接接种到性能测试的液体培养基中，按适合的培养温度和时间进行培养,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.3.4,结果解释：用目测的浊度值（如,0,2,）评估培养基,0,表示无混浊,1,表示很轻微的混浊,2,表示严重混浊,2.4,悬浮培养基和运输培养基的定性测试方法,2.4.1,培养基的制备：将培养基分装试管，每管,10ml,2.4.2,工作菌悬液的制备：将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜作为工作菌悬液。,2.4.3,接种：用,1uL,接种环取,1,环工作菌悬液直接接种到装有待测培养基是试管中，混匀后，立即用,10uL,接种环取,1,环划平行线接种平板，按规定培养后，剩余已接种菌液的待测培养基置,20 25,放置,45min,后，再用,10uL,接种环取,1,环划平行线接种平板。,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,2.4.4,结果观察与解释,接种前后平板上目标菌的生长情况应均为良好。,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,培养基,状态,功能分类,质控,指标,培养条件,质控菌株,定性质控评定标准,平板计数,固体,非选择,性计数,生长率,36,+,1,24h,+,2h,大肠、金蒲、枯草,G6,孟加拉,红培养基,固体,选择性计数,生长率,28.0,+,1,5,天,酿酒酵母,黑曲霉,G6,选择性,大肠、金蒲,G1,亚硫酸,铋琼脂,固体,选择性分离,生长率,36,+,1,40h48h,伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌,G6,选择性,大肠埃希氏菌、粪肠球菌,G1,XLD,固体,选择性分离,生长率,36,+,1,18h24h,鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌,选择性,大肠、金蒲,MAC,固体,选择性分离,生长率,36,+,1,20h24h,大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌,G6,选择性,金蒲,G1,GB4789.28-2013,培养基和试剂的质量要求,食品微生物检测实验室质量控制,基本概念,质量保证：一般适用于有合同场合，主要目的使客户确信实验室提供是服务能满足规定的质量要求。（侧重于控制措施，操作技术和方法）,质量控制：主要是指为达到和保持质量而进行控制的技术措施和管理措施反面的活动。（侧重于控制结果的证实，以提供充分的信任）,微生物检测质量控制,1,、外部质量评估：机构间比对、能力验证,2,、内部控质,2.1,设置对照：空白对照、阴性对照、阳性对照。,2.2,不同,人员间的比对：,2.3,不同,设备比对,2.4,不同,方法比对,注：微生物样品本身的不均匀性影响检测结果一致性。应排除此干扰的影响，才能正确实施评价。同一操作者对同一平板复核自己 的计数结果，差异应在,5%,之内，而其他人员对同一平板重复计数，其差异应在,10%,之内。,食品微生物检测实验室质量控制,列如,GB4789.10-2010,中在做血浆凝固酶试验时，应有三个对照,肉汤培养物,阴性对照,阳性对照,表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,食品微生物检测实验室质量控制,2.5,模拟阳性样品试验,2.6,、针对微生物定量检测项目，应定期使用有证标准物质,/,标准样品进行监控，或使用质控样品开展内部质量控制活动。,2.7,、针对微生物定性检测项目，应定期使用标准物质,/,标准样品、质控样品或用标准菌种人工污染的样品开展内部质量控制。,2.8,、实验室应根据工作量、人员水平、能力验证结果、外部评审等情况对定期做出明确规定，如定量检测项目,6,次,/,年，定性检测项目,4,次,/,年。,2.9,实验室内部比对,ISO4833,：,2003,中对结果重复性规定：用相同的方法，同一实验材料，在相同的条件下获得的一系列结果之间的一致程度。相同的条件是指同一操作者、同一设备、同一实验室和短暂的时间间隔。在此条件下所得的独立测试结果之差的绝对值不能大于重复性极限，即,R=0.25,食品微生物检测实验室质量控制,2.9.1,即第一次测试人员的测试结果为,10,5,=100000,，第二次测试人员的结果下限为,Lg10,4.75,=5600,结果上限为,Lg10,5.25,=178000,。如测试结果在,56000,和,178000,之间，则可认为两个测试结果的差值可以接受。如表所示,测试结果,第一测试人员,第二测试人员,测试值,1000000,2800,86000,190000,结果判定,不可接受，低于下限值,可接受,不可接受，高于下限值,若使用同一质控样品进行测试，两次测试结果超出差值范围的上限或下限值时，则可能是检测,人员操作失误引起的，应及时检查找原因并纠正。,相关微生物检验的国标,国标,内容,国标,内容,GB19489-2008,实验室生物安全通用要求,GB 50346,实验室建筑技术规范,GB/T27405-2008,实验室质量控制规范，食品微生物检测,SN/T1538,培养基制备质量保证通则,GB 4789.28-2013,食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求,GB/T16293,医药工业洁净室（区）浮游菌菌的测试方法,GB 14881-2013,食品生产卫生通用卫生规范,SN/T27405,实验室质量控制规范，食品微生物检测,GB 7781-2011,食品安全国家标准预包装食品标签通则,GB11674,乳清粉和乳清蛋白粉,GB 5749-2006,生活饮用水卫生标准,GB31617,食品营养强化剂,GB 29921-2013,食品中致病菌限量,GB/T16294,医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法,GB 7101-2015,食品安全国家标准饮料,GB 16740-2014,保健（功能）食品通用标准,GB 4789.18-2010,乳与乳制品检验,GB/T18202,室内空气臭氧卫生标准,GB 17405-1998,保健食品良好生产操作规范,GB 15981,消毒与灭菌效果的评价方法与标准,GB 19489,实验室生物安全通用要求,相关微生物检验的国标,国标,内容,GB 4789.1-2016,食品微生物检验总则,GB 4789.2-2016,菌落总数测定,GB 4789.3-2016,大肠菌群,GB 4789.4-2016,沙门氏菌检验,GB 4789.5-2012,志贺氏菌检验,GB 4789.10-2016,金黄色葡萄球菌,GB 4789.11-2014,溶血性链球菌检验,GB 4789.15-2016,霉菌和酵母菌计数,GB 4789.38-2012,大肠埃希氏菌,保健食品生产许可现场核查内容,1,、批准质量标准、取样方法、检验方法、和其它质量管理规程,2,、监督厂房和设施设备的维护情况,3,、洁净区与非洁净区以及不同级别的洁净室之间应设缓冲锁装置，放置空气倒灌。洁净间与室外的静压差应不当与小于,10Pa,，洁净级别不同相邻洁净室之间的静压差一般不小于,5Pa,，并配备压差指示装置,4,、洁净间温度,1826,度，相对湿度,45%65%,5,、批生产记录应按批号归档，保存至产品保质期后一年，保存期限不得少于,2,年。,6,、每批保健食品要按照企业标准的要求进行出厂检验，每个品种每年要按照产品技术要求至少进行一次全项目形式检验。,7,、致病菌检测的阳性对照、微生物限度检定要分室进行，并采取有效措施，避免交叉污染。,GB7101,食品安全国家标准饮料,饮料：经过定量包装的，供直接饮用或用水冲调饮用的，乙醇含量不超过质量分 数为,0.5%,的制品,微生物限量：,致病菌限量应符合,GB29921,（食品,中致病菌,限量）的规定,食品添加剂应符合,GB2760,营养强化剂,GB14880,