微生物学-09b微生物与基因工程.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,HNCU,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程技术,基因工程（,genetic engineering),：把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。,基因工程大事记,1973 Cohen,和,Boyer,第一次将重组体,DNA,转化大肠杆菌，实现了,DNA,的分子克隆,;,1978 Genentech,公司,-,人胰岛素,-,世界上第一种基因工程蛋白药物,1982,第一个基因工程药物,-,重组人胰岛素在英、美获准使用,1985,第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,1993,基因工程西红柿在美国上市,1997,英国罗斯林研究所,-,克隆羊多莉,1999.9,中国获准加入人类基因组计划,负责测定人类基因组全部序列的,1%,2000.6.26,科学家公布人类基因组工作草图,2001.2.11,公布人类基因组基本信息,一切基因工程操作都离不开微生物,1,、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成的。,2,、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。,3,、微生物细胞是基因克隆的宿主。,4,、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。,5,、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。,6,、模式生物提供基础理论。,二、微生物与基因工程关系,9.2,微生物与克隆载体,载体,：克隆载体、表达载体、穿梭载体,克隆载体,：外源,DNA,片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以扩增外源,DNA,为目的载体，称为,克隆载体,。,克隆载体应具备的性质,1,、可独立自主复制，具备复制原点；,2,、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。,3,、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。,目前克隆载体种类,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13,噬菌体载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体。,一、质粒载体,1,、特点：,（,1,）具有独立复制起点；,（,2,）具有较小的相对分子质量。,1,200kb,，外源,DNA15kb,；,（,3,）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终浓度,10,20g/ml,，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主,DNA,合成终止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝；,（,4,）具有便于选择的标记；,（,5,）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞；,（,6,）具有安全性。,pBR322,的结构特征,环状双链,DNA,分子，由,4361bp,组成，松驰型,;,colE,复制起点，外源,DNA,大小为,5kb,左右,;,四环素抗性基因（,Tet,r,）、氨苄青霉素抗性基因（,Amp,r,）,;,24,单一酶切位点（,Tet,r,中,7,个，,Amp,r,中,3,个）。,插入失活筛选转化子,插入失活,：,pBR322,抗生素抗性基因内有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子，插入新的,DNA,片段，新,DNA,片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象称,如,BamHI,可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。,筛选重组,pBR322,按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。,pUC,质粒载体,一个复制起始位点,具有更小的分子量：,2.8kb,更高的拷贝数，每个细胞大约,500,各拷贝,具有多克隆位点,MCS,区段,携带了氨卞青霉素抗性基因（,amp,R,）,多克隆位点区位于,lacZ,基因中，在此位点上插入外源基因会导致,lacZ,基因失活，可利用,蓝白斑筛选,重组子。,质粒的不足,（,1,）外源,DNA15kb,。,（,2,）转化效率低，约,0.1,的转化率。,二、,噬菌体克隆载体,噬菌体的优点：,（,1,）遗传背景清楚；,（,2,）容纳外源,DNA23kb,。,（,3,）高感染率,100%,，体外包装上外壳蛋白。,缺点：,DNA,分子很大；限制酶有很多切点，且多位于必需基因内。,噬菌体克隆载体的构建,a,、缩短长度,野生型,DNA,包装的上限为,50.5kb,，本身长度为,48.5kb,，插入片段至多为,2.0kb,，如果将其缩短便能够提高装载量。,I,插入型载体,经改造后的长度为,37kb,，为包装的下限，插入片段最大为,13.5kb,（,50.5-37kb,）,由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分组子与非重组子必须携带标记基因。,II,取代型载体,经改造后的长度约为,40kb,，含两个酶切口，两者间的距离为,14kb,，然后用外源,DNA,片段取代之。包装下限为,37kb,，,这类载体不需要标记基因，因为空载的载体,DNA,只有,26kb,，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。,b,删除重复的酶切口,插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天然的,DNA,上有许多重复的酶切口，如：,EcoRI 5,个，,HindIII 7,个，这些多余的酶切口必须被删除,噬菌体载体的优点,可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌,装载外源,DNA,的量大（,23kb,）,重组,-DNA,的筛选提取方便,噬菌体载体常用于构建基因文库。,柯斯质粒载体（,COS,载体，粘粒载体）,考斯质粒是含有,-DNA,两端,cos,区的质粒,考斯质粒的构建,由于,-DNA,包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序,cos,区。将这段,DNA,与质粒连在一起，构建的重组质 粒，可装载外源,DNA,（,45.5kb),，它仍可象,-DNA,一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。,考斯质粒的优点,能象,-DNA,一样体外包装，并高效导入受体细胞,可以装载更大的外源,DNA,片段，可装载,45.5kb,。,携带质粒的选择标记，便于筛选,有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,M13,噬菌体载体,1,、,M13,噬菌体基本特点：,（,1,）,M13,噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；,（,2,）,M13,噬菌体的基因组为单链,DNA,，由,6407,的碱基组成；,（,3,）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体,DNA,（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链,DNA,，用于,DNA,的复制，因此这种双链,DNA,称为复制型,DNA,（,replicative form DNA,），即,RF DNA,；,M13,噬菌体的改造,野生型,M13,不适于作为克隆载体，因此人们对野生型,M13,进行了改造，构建了一系列,M13,克隆载体。,在,M13,基因组中，除基因间隔区（,IG,）外，其他均为复制和组装所必需的基因。,外源,DNA,插入,IG,区，可不影响,M13,活动，因此对野生型,M13,的改造主要在,IG,区中进行。,插入,半乳糖苷酶选择标记,在,IG,区中插入,半乳糖苷酶,N,端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码,半乳糖苷酶的,肽，,肽可与大肠杆菌,LacZ,突变基因,M15,进行,互补，产生具有活性的,半乳糖苷酶。,若将,M13,和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代,-D-,半乳糖苷,(IPTG),和呈色物质,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,(Xgal),培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。,插入一小段多克隆位点区,在,肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的,DNA,片段，当外源,DNA,插入到这一区段，则会破坏,互补作用。这时若将,M13,（含外源,DNA,）和宿主细胞涂布在含有,IPTG,和,Xgal,培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。,M13,载体克隆外源,DNA,的能力较小，一般只适于克隆,300,400bp,的外源,DNA,片段；,它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链,DNA,。因此，它主要被用于制备测序用单链,DNA,模板、特异的单链,DNA,探针，定位诱变等。,表,9-1,几类大肠杆菌克隆载体比较,载体类型,克隆外源,DNA,片段大小,主要用途,质粒载体,15kb,克隆和表达外源基因；,DNA,测序,噬菌体载体,23kb,构建基因文库和,cDNA,文库,柯斯质粒载体,45kb,构建基因文库,M13,载体,300400bp,制备单链,DNA,；定位诱变；噬菌体展示,三、真核生物的克隆载体,1.,酵母质粒载体,酵母质粒载体都是利用其,2m,质粒和其酵母染色体组分与细菌质粒,pBR322,构建而成的。可分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。,主要有三种：附加体质粒、,复制质粒、整合质粒,（,1,）附加体质粒（,episomal plasmid,）,结构：,pBR322,的复制起点、,Ampr,（氨苄青霉素抗性基因）；,2m,的复制起点；酵母选择标记的,URA3,基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因,3,）。,细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。,（,2,）复制质粒,含有：来自细菌质粒,pBR322,的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（,Ampr,）和四环素抗性基因（,Tetr,）。来自酵母染色体的自主复制序列（,ARS,）；作为酵母选择标记的,URA3,基因和,TRP1,基因（色氨酸合成酶基因,1,）。,这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。,（,3,）整合质粒,含有：来自,pBR322,的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（,Amp,r,）、四环素抗性基因（,Tet,r,）。来自酵母的,URA3,基因；它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体,DNA,进行同源重组。,这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体,DNA,的一个片段。,2.,真核生物病毒载体,（,1,）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病毒如,SV40,，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。,（,2,）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（,100kb,）；其次具有高表达效率（,25,）；安全，仅感染无脊椎动物；,（,3,）植物病毒载体,四、人工染色体,酵母人工染色体（,YAC,）：能容纳最大外源,DNA,片段。,1,、组成：着丝粒（,centromere,，,CEN,）、端粒（,telomere,，,TEL,）、酵母自主复制序列（,ARS,）、选择性标记（如,URA3,）。,2,、功能：大片段克隆（,100,万,bp,），多用于真核生物基因库的载体。,3,、相关：细菌人工染色体（,BAC,）。,常用工具酶种类,内切酶,把,DNA,长链切割为短的,片段,连接酶,将,2,段,DNA,片段拼接起来,聚合酶,催化合成形成核酸链,末端转移酶,片段末端加接多聚核苷酸,核酸酶,水解酶，非专一性,反向转录酶,逆转录酶,9.3,微生物与基因工程工具酶,一、限制性内切酶,1,、限制性内切酶的定义,是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链,DNA,分子中的某种,特定核酸序列,并由此切割,DNA,双链结构的酶统称为,限制性内切酶。,限制性内切酶的发现,Luria,和,Human,发现细菌能将外来的,DNA,片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的,DNA,由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做,限制修饰,。,Smith,和,Wilcox,从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割,DNA,，这个酶被命名为,Hind I,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。,3,、限制性核酸内切酶的命名,按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。,例如：从流感嗜血杆菌,d,株（,Haemophilus influenzae d,）中先后分离到,3,种限制酶，则分别命名为,Hind,、,Hind,和,Hind,。,4,、限制性内切酶的类型,限制性内切酶可分为三大类型：,类型,I,和类型,III,：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。,类型,II,的特点,:,识别位点严格专一；识别序列的碱基数一般为,4,、,6,、,8,个,bp,；识别位点经常是一种回文序列的,DNA,；是,DNA,重组技术最为常用的工具酶。,寡核苷酸顺序具有二冲旋转对称轴，又称为,回文顺序,（,palindromic sequence,）,GAA TTC,CTT AAG,也有一些对称顺序被一个或几个非特定的核苷酸间隔开。,N-,四种均可,Py-,嘧啶,Pu-,嘌呤,如,GTPyPuAC Hind I,6,、限制性内切酶的切割方式,就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种,:,在对称轴,5,侧切割产生,5,粘端,在对称轴,3,侧切割产生,3,粘端,在对称轴处切割产生平,二、,DNA,连接酶,配对的碱基产生的氢键还不足以把两个,DNA,分子拴在一起，还需要通过,DNA,连接酶在,3,羟基和,5,磷酸基团之间形成新的,磷酸二酯键,。,大多数,DNA,连接酶都是从,T4,噬菌体中分离出来的，它可以催化在两条,DNA,链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两条,DNA,链和末端都是平末端的两条,DNA,链,其它常用工具酶,3.Tag DNA,聚合酶：是一种耐热的依赖于,DNA,的,DNA,聚合酶，具有,5 3,聚合酶活性，该酶最适反应温度为,7580,，主要用途是进行,PCR,反应。,4.,逆转录酶（依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶）主要作用是将,mRNA,反转录成,cDNA,（二）碱性磷酸酶,其作用是去除,DNA,、,RNA,的,5,磷酸根（,5-P,），以防自身环化；另外在用,32,P,标记,5,末端前，可先用其去除,DNA,或,RNA,上的,5-P,（三）核酸酶,S1,核酸酶：主要用于去除,DNA,片段粘末端而产生平端；打开,cDNA,中发夹结构，使其成平端。,核糖核酸酶（,RNaseA),：在质粒提取时降解,RNA,；从,DNA-RNA,杂交体中去除未杂交的,RNA,区。,9.4,微生物作为克隆载体的宿主,一、宿主的基本要求与性质,1,、能够高效吸收外源,DNA,；,2,、具有使外源,DNA,进行高效复制的酶系统；,3,、不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源,DNA,发生降解；,4,、一般为重组缺陷型（,RecA-,）菌株，使克隆载体,DNA,与宿主染色体,DNA,之间不发生同源重组；,5,、便于进行基因操作和筛选；,6,、具有安全性。,二、原核生物宿主,1,、首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞：,噬菌体载体,E.coli k12,菌株、,M13,含有,F,因子的雄性大肠杆菌。,2,、其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。,3.,最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。,三、真核生物宿主（酿酒酵母）,利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。,第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；,第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。,酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。,四、外源基因导入宿主,1,、外源,DNA,导入导入原核细胞,（,1,）转化和转染：外源,DNA,以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；外源,DNA,构建成重组噬菌体,DNA,或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入 宿主细胞。,感受态细胞：用氯化钙处理宿主细胞，使细胞变得易于吸引外源,DNA,。,（,2,）,DNA,的侵染（体外包装转染技术）,体外包装（将重组,DNA,分子与,噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，组装成具感染力的,噬菌体粒子）感染宿主。,较转染效率要高出,10,4,10,5,倍。,2,、外源,DNA,导入真核细胞,（,1,）外源,DNA,导入酵母细胞,酵母细胞,原生质体,蜗牛酶,CaCl2,和聚乙二醇,复合体（含,DNA,的原生质体）,长出有壁细胞,再生培养基中,（,2,）外源,DNA,导入哺乳动物细胞,其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。,（,3,）外,DNA,导入植物细胞：除了微量注射法及电穿孔法可将外源,DNA,导入植物细胞外。,还有两种方法，一种是基因枪法或称微弹枪法；另一种是将含有重组,Ti,质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片培养（即叶片培养法）。,五、基因文库与,cDNA,文库的构建,利用重组,DNA,技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库,(genomic library),或,cDNA,文库,(cDNA library),1.,基因文库的构建,所谓基因文库是指生物染色体基因组各,DNA,片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的,DNA,片段。,一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部,DNA,序列）。,2,、基因文库的构建步骤：,（,1,）从组织或细胞提取基因组,DNA,；,（,2,）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度,DNA,片段，经分级选出一定大小合适克隆,DNA,片段；,（,3,）选择容载量较大的克隆载体，通常采用,噬菌体或 柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；,（,4,）将基因组,DNA,片段与载体进行体外连接；,（,5,）重组体,DNA,直接转化细菌或用体外包装的重组,噬 菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组,DNA,的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。,2.cDNA,文库构建,所谓,cDNA,文库是指生物体全部,mRNA,的,cDNA,克隆总体。,cDNA,文库中的每一个克隆只含一种,mRNA,信息。,由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的,mRNA,分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有,15%,左右基因被表达），因而若由,mRNA,逆转录为,cDNA,，那么所构建的,cDNA,文库的库容量相应比基因文库小。,构建,cDNA,文库的主要步骤：,从生物体或细胞中提取,mRNA,。,利用逆转录酶以寡聚,(dT),或随机寡聚核苷酸为引物合成,cDNA,的第一条链。,利用,DNA,聚合酶,I,，以,cDNA,第一条链作为模板，用适当引物合成,cDNA,第二条链,;,常用,RNA,酶,H,在杂交分子的,mRNA,链上造成切口和缺口，产生一系列,RNA,引物,;,或是除去杂交分子的,mRNA,后，加入随机引物，即可合成第二条链。,cDNA,与载体的体外连接。,噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于,cDNA,不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。,六、重组体的筛选与鉴定,1.,重组体表型特征的鉴定,2.,重组,DNA,分子结构特征的鉴定,3.,外源基因表达产物的鉴定,1.,重组体表型特征的鉴定,(1),抗生素平板法,(2),插入失活法,(3),插入表达法,(4)-,半乳糖苷酶显色反应法,抗生素平板法,缺点,:,假阳性高,插入失活法,因外源,DNA,的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（,insertional inactivation,）,插入表达法,在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源,DNA,片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。,例如质粒,pTR262,有一个负调控的,cI,基因，当外源,DNA,片段插入,cI,基因中的,BcII,或,HindIII,位点，造成,cI,基因失活，位于,cI,基因下游的,tet,基因（受,cI,基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；,-,半乳糖苷酶显色反应法,兰,-,白斑筛选：某些载体，如,M13,，,PUC,系列，,PGEM,质粒系列等，都带有,lac Z,基因的一段序列，编码,半乳糖苷酶的,肽；而宿主细胞为,Lac Z M15,的突变株时，,肽可与,M15,进行,互补，产生具有活性的,半乳糖苷酶。,若将转化细胞涂布在含有异丙基硫代,-D-,半乳糖苷,(IPTG),和呈色物质,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,(Xgal),培养基的平板上时，可形成蓝色菌落。,当外源,DNA,插入到这一区段，则会破坏,互补作用。这时若将转化细胞涂布在含有,IPTG,和,Xgal,培养基的平板上，则形成无色菌落。,2.,重组,DNA,分子结构特征的鉴定,菌落（或噬菌斑）原位杂交（,in situ,hybridization,）,内切酶图谱鉴定,PCR,鉴定,菌落（或噬菌斑）原位杂交,将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。,翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出,DNA,。,再用碱处理，使,DNA,变性，经烘烤将变性,DNA,固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。,内切酶图谱鉴定,将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体,DNA,，用,12,种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入,DNA,片段大小。,双酶切鉴定重组质粒,PCR,鉴定,通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒,DNA,作为模板进行,PCR,分析，可快速测出插入,DNA,片段大小及鉴定其序列特异性。,DNA,序列测定,最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的,DNA,进行序列测定,外源基因表达产物的鉴定,表达产物免疫活性测定,表达产物生物活性检查,表达产物氨基酸序列测定,表达产物免疫活性测定,Western blot with anti-Sak antisera(rabbit),表达产物生物活性检查,表达产物氨基酸序列测定,一般分析,N-,末端（,15,个残基序列）和,C-,末端（一般,5,个）氨基酸鉴别蛋白质的性质和同质性；,9.5,表达载体的构建,基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。,所谓表达载体（,expression vector,）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。,用原核细胞表达真核生物基因时，应注意的问题,基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的,cDNA,；,基因必须置于原核细胞启动子、终止子和,SD,序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别；,产生的,mRNA,必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。,一 主要调控元件,启动子,核糖体的结合位点,转录终止信号,（,1,）、启动子（,promoter,）,启动子是指,RNA,聚合酶结合于,DNA,并起始合成,RNA,的一段,DNA,控制序列。,原核基因启动子位于转录起点（,transcription initiation,）上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。,一个称为,-10,区，位于转录起点上游约,10bp,处；,RNA,聚合酶于该处解开,DNA,双链，并决定转录起点；,另一个称为,-35,区，位于转录起点上游约,35bp,处，是,RNA,聚合酶识别并结合的位点。,原核表达系统中常用启动子,lac,启动子，是乳糖操纵子的启动子，受,lac I,编码的阻遏蛋白调节控制；,trp,启动子，是色氨酸操纵子启动子，受,trpR,编码的阻遏蛋白调控；,tac,启动子，由,lac,启动子的,-10,区和,trp,启动子,-35,区融合而成，汇合了,lac,和,trp,两者优点，是一个很强的启动子，同样受,LacI,阻遏蛋白调控。,P(L,、,R),启动子，是,噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控；,T 7,噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被,T 7 RNA,聚合酶所识别。,核糖体结合位点,原核微生物的,mRNA,结合核糖体的序列最初是由夏英（,Shine,）和达尔加诺（,Dalgarmo,）发现的，因此称为,SD,序列,;,在大肠杆菌中，核糖体结合点包括起始密码子,(AUG),及位于起始密码子上游,11bp,处，长度为,bp,的序列,;,这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与核糖体小亚基上,16S rRNA 3,端一段富含嘧啶的保守序列互补，从而带动核糖体与,mRNA,的结合。,转录终止子,转录终止子指一段位于基因或操纵子的,末端，具有终止转录功能的特定,DNA,序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的,mRNA,过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使,mRNA,形成妨碍翻译的二级结构。,密码子的偏爱性,由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。,在原核生物细胞中，对于,tRNA,丰富的密码子称为偏爱密码子（,biased codons,），而对应于,tRNA,稀少的密码子称为稀有密码子（,rare codons,）,二 表达载体中调节开关的作用,通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；,宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。,第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。,第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。,外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种不同方法。,化学物质诱导,当用,lac,启动子构建表达载体时，,lac,启动子受,CAP,蛋白和,cAMP,的正调控。受阻遏蛋白的负调控；,当宿主细胞生长时，,lac I,基因产生的阻遏蛋白与,lac,操纵基因结合，阻碍外源基因的转录和表达，此时细胞大量生长和繁殖。加入诱导物,IPTG,后，由于诱导物与阻遏蛋白结合，使其不能与操纵基因结合。于是，外源基因被诱导而高效转录和表达。,现在基因工程所用,lac,启动子常用其经紫外诱变改造的启动子,lac UV5,。该启动子失去,CAP,和,cAMP,的正调控，只要有乳糖或,IPTG,存在时就能够启动转录。,温度诱导,当用,PL,、,R,启动子构建表达载体时，,PL,、,R,启动子受,噬菌体,cI,基因的负调控，,cI,基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。,目前利用,cI,的温度敏感突变基因（,cI 857 ts,）调节这种阻遏。,当在,28-30,培养时，该突变体产生有活性阻遏蛋白，阻遏,PL,、,R,转录，细菌大量生长。,在获得足够量菌体后，使温度上升至,42,，造成阻遏蛋白失活，,PL,、,R,解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。,三 非融合蛋白的表达,为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子,ATG,的真核基因插入到合适的原核启动子和,SD,序列下游。,经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。,外源蛋白的分泌表达,分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。,通常信号肽与外源蛋白的,N,端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸和疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。,包涵体（,inclusion body,）,当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。利用大肠杆菌生产的非融合蛋白多数情况下以包涵体形式存在。,形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对其的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具生物学活性，需要体外复性。,四 融合蛋白的表达,所谓融合蛋白是指蛋白质的,N,端由宿主基因（通常只是,N,端的部分序列）编码，,C,端由外源基因编码的蛋白质，,换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。,表达融合蛋白的优点,融合蛋白较易获得高效表达。融合蛋白的,N,端总是选择天然的高表达的宿主蛋白质，其,mRNA,具有较强的翻译能力；,融合蛋白在细胞内比较稳定。外源蛋白特别是相对分子量较小的蛋白，通常在宿主细胞内极易被胞内蛋白酶所清除。但是如果构成融合蛋白，就可使外源蛋白不受宿主细胞降解；,易于纯化。,9.6 DNA,的合成、体外扩增,1,、,DNA,的合成,自,DNA,合成仪问世后，化学合成已可完全自动化，在半个小时内可合成,3035,个碱基的寡核苷酸。,目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为,150200,个核苷酸左右。,PCR,扩增技术的原理和应用,聚合酶链式反应（,polymerase chain reaction,PCR,），是一种在体外快速扩增特定,DNA,序列的新技术。,如果,DNA,片段两端的序列是已知的，则先要合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的靶,DNA,片段的末端互补。,PCR,由,3,个基本反应组成。变性,:,加热，模板,DNA,经热变性，成为两条单链；退火,:,使温度下降，寡核苷酸引物即与模板,DNA,中所要扩增序列两端的碱基配对；延伸,:,在适宜条件下引物,3,端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的,DNA,链。,DNA,片段以,2,的指数增长，重复,2530,次循环，扩增的,DNA,片段拷贝数可增至,10,6,-10,7,倍。,PCR,扩增技术原理,PCR,技术的实际用途,可用于,DNA,的扩增和克隆，制备单链或双链,DNA,探针；也可用于定位诱变和,DNA,测序。,在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。,用于法医,以鉴别个体和判定亲缘关系。,基因诱变,寡核苷酸介导的突变,盒式诱变,PCR,介导的突变,9.7,基因工程的应用,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,在微生物研究中应用,基因工程药物,胰岛素,人生长激素,干扰素,白细胞介素,2,粒细胞集落刺激因子,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,红细胞生成素,EPO,组织纤溶酶原激活剂,生长激素,促生长素,抗血友病因子,脱氧核糖核酸酶,葡糖脑苷脂酶,鼠单克隆抗体,基因工程药品,胰岛素,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每,100kg,胰腺只能提取,4,5g,胰岛素。,用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。,1979,年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌,DNA,分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。,1982,年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了,30%,50%,。,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。,传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每,300 L,血液只能提取出,1 mg,干扰素。,1980,1982,年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的,12,万倍。,1987,年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品,干扰素,基因工程药品,生长激素,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。,现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从,450 L,大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于,6,万具尸体的全部产量。,基因工程药物的生产过程,1,、目的基因的提取：分离或合成外源基因。,2,、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组,DNA,分子；,3,、转化：重组,DNA,分子导入细胞。,4,、筛选与鉴定；,5,、基因表达：控制适当条件，外源,DNA,表达。,6,、表达产物的纯化,下面以胰岛素为例介绍基因工程药物的生产过程,A,链和,B,链分别表达法,基因工程菌的构建战略：,化学合成,A,链序列,表达产物的后处理路线,人胰岛素原表达法,A,链和,B,链同时表达法,上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌,b-,半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，以包涵体的形式存在于胞质中。,基因治疗,1990,年,9,月,14,日，美国马里兰州的,Bethesda,医院里，年仅,4,岁的女孩阿尚蒂,(Asshanthi DeSilva),接受了人类历史上第一次基因治疗临床试验，为其主持治疗的是美国国立卫生研究院的,C,W,Blease,教授、,K,W,Culver,教授和,(French Anderson),教授等。,阿尚蒂忠有一种严重的复合型免疫功能缺乏症（,SCID,），这是一类致命性遗传性疾病。,该疾病如果不加治疗，患者在,l,2,年必死无疑。所幸的是世界上这种疾病非常罕见，在美国每年只有,40,名患儿出生。,阿尚蒂就是由于先天性缺乏腺苷脱氨酶,(ADA),而导致,SCID,的,由于,ADA,酶的缺陷，人体细胞内脱氧腺苷大量积累，导致,T,淋巴细胞的中毒死亡；没有了,T,淋巴细胞，人体免疫系统就基本上被破坏了，这种情况类似于艾滋病患者晚期，很容易感染死亡。,阿尚蒂只有生活在无菌的隔离病房，依赖没完设了的,PEGADA,酶的体外注射，通过这种外源,ADA,酶补充体内的不足,ADA,酶进入细胞谈何容易？低效的治疗，频繁的输注、昂贵的价格、潜在的病毒危害、免疫反应让阿尚蒂的生命看不到明天的希望。,正是由于这种疾病的特殊性，该病成为基因治疗早期探索和开展临床试验的理想病种。,1990,年美国政府终于批准了世界上第一例基因治疗临床试验对阿尚蒂实施,ADA,基因治疗。,医生和科学家们从阿尚蒂身上抽血，从中分离出少量的,T,淋巴细胞（患者体内,T,细胞数量很少），在体外进行生长和扩增，通过一种改造的反转录病毒将正常的,ADA,基因转移进去,;,虽然，这种方法并没有修复她缺陷的,ADA,基因，但是可以代偿性表达原来基因缺陷，使得不少淋巴细胞可以大量表达,ADA,酶。,在从阿尚蒂身上取血培养一个半星期后，这种改造过的能够正常表达,ADA,的淋巴细胞通过常规的静脉缓缓地输回到女孩的血液中。基因手术结束后，阿尚蒂一切体征正常。,1,个月后，阿尚蒂再次接受了遗传改造细胞的回输。她先后经过,11,次的细胞回输，一共回输了约,10,11,个基因改造淋巴细胞。,1,个月后，就发现她体内的正常,T,细胞数量上升，从阿尚蒂体内取出血液进行细胞功能分析，她的,T,细胞已经能够生产,ADA,酶，虽然只有正常值的,20%,，但是已经能够拯救,T,细胞死亡的命运了，能够使,T,淋巴细胞保持一定的生长并能维持一定的免疫功能。,阿尚蒂体内能够产生抗体，杀死病毒感染的细胞，这表明她体内具有了一定的免疫功能，而这对于,SCID,患者而言是极其重要的，这神奇的效果达到了甚至远远超过了科学预期结果。,基因治疗基础篇,人类医学史上第一次通过基因治疗在阿尚蒂身上创造的奇迹般的成功，是一场医学领域的革命，这次临床试验正式标记着基因治疗的解禁的开始,;,随后，世界范围内掀起了一股基因治疗研究的热潮，基因治疗得到了令人意想不到的发展，已经成为生物科学和临床科学领域的热