发育生物学课件1.ppt

Developmental Biology,第一章 序 言,一、前言,(一)概念,发育生物学是一门研究生物体从精子和卵子发生、受精、发育、生长到衰老、死亡规律的科学。,发展基础：胚胎学、遗传学、细胞生物学。,发展过程：,形态 机理,组织器官 细胞 分子,本课程的主要讲授内容,序言：发育生物学中的一些基本原理；发育生物学中的动物模型；发育生物学中的现代技术。,胚胎的早期发育：卵裂、原肠作用、神经胚作用。,细胞分化的机制：侧重基因表达的调控对组织器官形成和分化的影响。,果蝇躯体轮廓发育的分子机制,四肢动物的肢体的发育,性别决定与生殖细胞,主要参考书,Scott Gilbert,编:,Developmental Biology，6th Editions,2000.,Lewis,Wolpert,主编：,Principles of Development，1998.,Klaus,Kalthoff,:Analysis of Biological Development，2nd edition,2001.,Bruce M.Carlson:Human Embryology&Developmental Biology,2nd Edition,1999.,17世纪，意大利胚胎学家 Marcello Malpighi观察到的鸡胚,17世纪，精原学说的代表人物Nicholas Hartsoeker,所想像的精子中的微型人,法国科学家Bonnet(1745)提出胚胎发育套装论,19世纪30年代末：,Mathias,Schleiden,和,Theodor Schwann,提出细胞学说。,1840,August,Weismann,提出了生殖细胞论，认为后代个体是通过精子和卵子继承亲本描述躯体特征的信息；卵子是一个细胞，其分裂产生的细胞可分化出不同组织，从而否定了,preformation,论。,19世纪对,Sea Urchin,受精卵的观察发现，,受精卵含有两个细胞核，并最终合并为一个细胞核，表明,细胞核含有遗传的物质基础。,19世纪末，染色体,的,发现,和发现染色体数目在发育中的变化规律，使孟德尔遗传定律有了物质基础。,2、细胞学说改变了胚胎发育和遗传的概念,3、Mosaic and Regulative Development,19世纪80年代，Weismann,提出了mosaic development学说：合子中的大量特殊因子在细胞分裂中不均等分配，导致了不同细胞向不同命运的发育。,3、Mosaic and Regulative Development(,续),支持嵌合体学说的实验证据：,Wilhelm Roux,的实验：,3、Mosaic and Regulative Development(,续),Wilhelm Roux,的同事Hans Driesch的下述实验表明，胚胎具有在局部被排除或受损伤后仍正常发育的能力，即,胚胎发育是可调节的,。,4、Discovery of Induction,1924,年，Hans Spemann和Hilde mangold的移植实验表明，,胚胎的一种组织可以指导另一种相邻组织的发育,。,5、遗传学、分子生物学与发育生物学的结合,1900年，孟德尔遗传定律研究遗传元素在世代间的传递。,1909年荷兰植物学家,Wilhelm,Johannsen,提出基因型和表现型的概念，首次使遗传学和胚胎发育学发生关系。,20世纪40年代证明：,DNA,是遗传物质,，,控制蛋白质的合成,。,20世纪50年代发现：,DNA,为双螺旋结构。,20世纪60年代：三联体密码被破解。,20世纪70年代：,DNA,重组技术出现。,20世纪80年代：转基因技术出现。,20世纪90年代：动物克隆技术出现。,世纪之交：,HGP。,新的突破：,stem cells,proteomics,conditional gene,knockout,mutagenesis,二、发育生物学研究中的主要模式动物,各种模式动物各有优点，其研究成果不仅可以揭示特定物种的特点，还有助于动物发育的一些普遍规律和机制。,(一)Invertebrate Models,主要优点1.体积小，易于繁 殖；2.产卵力强；3.性成熟短；4.易于遗传操作：如诱变；5.基因组序列已全 部测出(Science,Mar.24,2000)。,(120Mb encodes 13,601 proteins),1.,Drosophila melanogaster,:Insect model,2、,Caenorhabditis elegans:,Worm model,主要优点1.易于养殖：成虫 体长1mm，,易冷 冻保存；2.性成熟短：2.5-3 天，两种成虫；3.细胞数量少，谱 系清楚；4.易于诱变；5.基因组序列已全部测出(Science,Dec.11,1998)。,(97MB encodes 19,099 proteins.),(二)、Vertebrate Models,1.,Xenopus laevis,:Amphibian model,主要优点1.性成熟短；2.卵体大，易于操 作；3.抗感染力强，易 于组织移植；,主要优点1.体积小，易于饲 养殖；2.产卵力强；3.性成熟短；4.易于遗传操作：如诱变；5.体外受精和发育，易于观察；6.基因组序列已全 部测出。,2.,Danio rerio,(zebrafish),3.,Mus musculus,(Mouse),4.,Gallus gallus,(Chicken),三、发育生物学中的基本概念及规律,(一)、Five major developmental processes,1.Cell division:,Cleavage:,细胞分裂快、没有细胞生长的间歇期，因而新生细胞的体积比母细胞小。,2.Pattern formation:,(1)躯体轴线的制定,2.Pattern formation:,(2)胚层的形成,3.Morphogenesis,最突出的形态变化发生在,原肠作用开始之后。,4.Cell dif-ferentiation:,人类胚胎可最后发育出至少250种不同细胞类型，分化通常是不可逆的。,5.Growth,胚胎在基本的pattern,形成之后，其体积会显著增长，原因在于,细胞数量增加、细胞体积增加、胞外物质的积累。,不同组织器官的生长速度也各异。,(二)、Cell Behaviour,Cell behavior,Gene Embryonic development,细胞行为主要包括：,Cell state:,指基因活性状况。,Cell-to-cell signaling:,细胞间信号的传送、接受、反应。,Cell movement and cell-shape changes:,细胞通过形态改变及运,动产生的机械动力，导致特殊结构的形成。,Cell proliferation:,躯体不同部位的细胞增生速度不一，可导致,整体结构的改变。,Cell death:,在特定的发育时期，特定部位的细胞的死亡是形成,正确结构所必需的。,(三)、基因控制细胞行为 是通过控制细胞中的蛋 白质的产生而实现的,House-keeping proteins:,几乎存在于所有类型细胞中，通常用于产生能量、在代谢途径中生成或降解产物，如组蛋白及转录或翻译中所必需的蛋白因子。,Tissue-specific proteins:,存在于特殊类型细胞中，从而赋予细胞特定的活性。如血细胞中的血红蛋白输氧、肌肉细胞合成myosin、actin、tropomyosin为收缩提供能量。包括酶、生长因子、受体蛋白、结构分子。,细胞可从多个方面来控制蛋白质的合成。,(四)、发育是渐进式的、细胞命运决定于不同的发育时间,Fate of cells:,指正常发育情况下细胞将发育的方向，这种方向可因条件的改变而改变(see next slide)。,Determination:,指细胞特性发生了不可逆的改变，发育潜力已经单一化。,Specification:,指一组细胞在中性环境下离体培养，它们仍按其正常命运图谱发育。,两栖动物眼区细胞的潜能随发育时期的不同而改变,原肠胚中眼区将发育为眼睛。,将原肠胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，它们将按新部位的命运发育为体节和脊索。,将神经胚中眼区细胞移植到神经胚的躯干区，它们仍将发育为类似于眼的结构。,胚胎发育早期，细胞的发育潜力更大！,(五)、诱导作用可使细胞互为不同,扩散性信号分子,跨膜蛋白的直接互作,间隙连接(gap junction),信号传导特点,传递距离有限,并非所有细胞都能对某种信号发生反应。,不同类型细胞可对同一信号发生不同反应,e.g.,乙酰胆碱使心肌收缩频率下降，但促使唾液腺分泌唾液。,Autonomous cell fate,non-autonomous cell fate,(六)、Patterning,常涉及positional information的翻译,(六)、Patterning,常涉及positional information的翻译(续),(七)、间距模式(spacing patterns),可通过侧向抑制作用产生,(八)、胞质决定成分的区域化及细胞的不对称 分裂使细胞具有不同的特性,线虫的不对称卵裂产生不同命运的卵裂球,二、传统的发育生物学研究技术,染料细胞标记,荧光细胞标记,细 胞 移 植,三、控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法,基因组时代：人类基因组计划,DNA,序列已经告诉了我们什么？,后基因组时代功能基因组时代,空间结构？,胞内分布及靶位？,影响器官？,基因类型？,底物？,影响途径？,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；,分离时空特异性表达基因的方法；,利用基因序列同源性的克隆法；,利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；,分离时空特异性表达基因的方法；,利用基因序列同源性的克隆法；,利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,隐性突变；,半显性突变,；,显性突变,突变体的类型,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,突变类型图示,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,自然群体中的突变体；,化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲(,N-,nitroso,-N-,ethylurea ethylnitrosourea,ENU)；,外源,DNA,插入法，如,DNA,注射、病毒感染、转座子利用等；,X,射线或,r,射线照射,获得突变体的方法,斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996),从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,化学诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,隐性突变体的鉴定方法,化学诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,反转录病毒插入引起的突变的鉴定,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,Expression of GFP in virus-infected fish,Transient,germline,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,An example of mutational phenotypes,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,DNA插入诱变法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因,Genetic mapping and chromosomal walking；,PCR or Southern hybridization；,Candidate cloning；,Differential display/subtractive cloning,从突变体克隆基因的方法,(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法,从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因；,分离时空特异性表达基因的方法；,利用基因序列同源性的克隆法；,利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。,分离时空特异性表达基因的方法,获取特定组织：直接取材或转基因法取材；,构建,cDNA,文库,；,从蛋白质到基因,；,Differentiatial,hybridization/differential display/subtractive cloning,分离时空特异性表达基因的方法,基因芯片/核酸杂交法,Subtractive cloning,分离时空特异性表达基因的方法,利用基因序列同源性的克隆法,用一个物种的基因直接做探针分离另一个物种的同源基因；,根据多个物种的蛋白序列分离另一个物种的同源基因,；,根据同一基因家族的不同成员间的保守序列分离新的家族成员,；,利用大分子间的相互作用克隆新的基因,鉴定可与蛋白质结合的,DNA,序列,分离靶蛋白质，（可采用,gel-shift assay),克隆靶蛋白的表达基因。,利用DNA,与蛋白质间的相互作用,分离时空特异性表达基因的方法,利用蛋白质之间的相互作用,酵母双杂交法,(二)、基因表达的检测,mRNA,的检测,蛋白质的检测,启动子活性检测,(二)、基因表达的检测,mRNA,的检测,蛋白质的检测,启动子活性检测,mRNA,的检测,Northern blot,Dot blot,RT-PCR,DNA,Microarray,in situ hybridization,Northern,杂交的作用：,检测基因的转录物的存在及是否发生了选择性拼接。,mRNA,的检测,原位杂交(,in situ,hybridization),利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱,mRNA,的检测,(二)、基因表达的检测,mRNA,的检测,蛋白质的检测,启动子活性检测,蛋白质,的检测,电泳法,Western blot,抗体染色法,(二)、基因表达的检测,mRNA,的检测,蛋白质的检测,启动子活性检测,启动子活性检测法,表达载体的构建：,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(,gene knockout),异位表达法(,ectopic,expression),Rescue,Antisense,RNA,Antisense oligos,DsRNA,interference(,RNAi,),Antibody blocking,Dominant negative receptor mutations,Dominant,interferring,allele,用基因敲除法研究基因的功能,三、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(,gene knockout),异位表达法(,ectopic,expression),Rescue,Antisense,RNA,Antisense oligos,DsRNA,interference(,RNAi,),Antibody blocking,Dominant negative receptor mutations,Dominant,interferring,allele,转基因动物与基因的异位表达,DNA注射；,RNA,注射；,病毒感染。,用组织特异性启动子控制外源基因的表达,绿色血液,绿色神经细胞,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(,gene knockout),异位表达法(,ectopic,expression),Rescue,Antisense,RNA,Antisense oligos,DsRNA,interference(,RNAi,),Antibody blocking,Dominant negative receptor mutations,Dominant,interferring,allele,(三)、基因对发育的影响的功能性研究,基因敲除法(,gene knockout),异位表达法(,ectopic,expression),Rescue,Antisense,RNA,Antisense oligos,DsRNA,interference(,RNAi,),Antibody blocking,Dominant negative receptor mutations,Dominant,interferring,allele,Dominant Negative Receptor Mutations,细胞膜,受体胞外区,受体跨膜区,突变,受体胞内区缺失导致信号传导的中断,受体胞内区,配体,配体,下游信号分子,Dominant Interferring allele,