乳酸菌的益生及免疫调节作用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Evaluation of probiotic characteristics of newly isolated Lactobacillus spp.:Immune,modulation,乳酸杆菌的益生特性及免疫调节作用,International Journal of Food Microbiology,Available online 13 May 2011,Keywords:Lactobacilli,Probiotic characteristics,Immune modulation,In the current study,the probiotic potential of approximately 350 strains of lactic acid bacteria isolated from Korean infant feces and Kimchi was investigated.Common probiotic properties of the bacterial strains,such as acid tolerance,bile tolerance and adhesion to human intestinal epithelial cells(HT-29 cells),were examined.,Some strains were found to have immune modulatory and antimicrobial properties.Antagonistic activity against a panel of pathogenic bacteria was found to be strain dependent.To evaluate the immune modulatory activity of the strains,lymphocyte interferon(IFN)-secretion was determined in conjunction with cell proliferation.,Some strains of Lactobacillus gasseri,L.fermentum and L.plantarum exhibited increased IFN-,levels and lymphocyte proliferation.To evaluate the effects of these immune modulating lactobacilli on host life span,Caenorhabditis elegans was used as an in vivo model.Nematodes that were supplied heat-killed lactobacilli as a food source exhibited obvious differences in life span compared with those fed Escherichia coli OP50.,The mean life span(determined as mean percent survival)of worms fed L.plantarum CJLP133 and,L.fermentum LA12 was 13.89%and 13.69%greater,respectively,than that of control nematodes after 21 days(P=0.036 and 0.043,respectively).In addition,some of safety profiles,including hemolytic type,gelatin hydration and degradation of urea,were found to be positive.,These newly identified lactobacilli hold promise for use as probiotic agents,feed additives and/or in food applications.,A,b s t r a c t,研究发现，从韩国婴儿的粪便及泡菜中分离出的乳酸菌大约有,350,株菌株有益生潜力。益生菌的普遍益生特性主要包括：耐酸性，耐胆盐及对人肠上皮细胞的粘附性。还有一些菌株有免疫调节作用及抗菌作用。一些细菌对致病菌有一定的抵抗作用。为了评估这株菌的免疫调节作用，测定淋巴细胞干扰素（,IFN,）,-,的分泌与增值。一些发酵乳杆菌和植物乳杆菌会使干扰素（,IFN,）,-,分泌增加及淋巴细胞的增值。一些安全指标，包括溶血性，明胶水化及尿素降解发现是阳性的。这些分离出来的菌株可以作为益生菌用于饲料及食物中。,1 Introduction,乳酸菌作为益生菌可以有益于人类健康及阻止人类疾病。乳酸杆菌是一个有较好益生效果的菌属。大量的研究证实许多的乳酸杆菌都有益生特性。虽然在传统的食品中乳酸杆菌作为益生菌有很长的历史了，但它作为益生作用及用于食品加工之前一些指标还是需要测定的。益生菌能够抵抗胃酸和胆盐，并能够定植于人体的肠道中。已经证实乳酸菌能够抑制致病菌的生长，如大肠杆菌，李斯特菌，沙门氏菌等。临床上也显示出了乳酸杆菌的有益作用，如降低胆固醇，预防腹泻，缓解乳糖不耐症，抗癌及免疫调节作用，这些都说明它具有益生功能。,近年来认为免疫调节作用对宿主肠道健康有很重要的作用。益生菌的益生作用被应用于功能性食品及药物制剂中，主要是由于这些微生物能够刺激宿主的免疫系统。对致病菌及微生物抗原的防御反应能够促进肠道成熟及完整性。一些体外实验也证明了乳酸杆菌具有抑制致病菌的作用。,本实验的研究主要集中在对从韩国婴儿粪便及泡菜中分离出乳酸杆菌的益生特性的研究主要集中在耐酸性（,acid tolerance,），耐胆盐（,bile tolerance,）及人体上皮细胞的粘附性上（,human intestinal epithelial cells,）。一些测试菌株表现出免疫调节作用及抗菌作用并且能够延长宿主的寿命。主要应用于亚洲人群的发酵乳杆菌和植物乳杆菌有潜在的益生特性。这些益生特性可以应用于功能性食品及饲料中。,2 Materials and methods,2.1 Isolation and preliminary identification,乳酸杆菌来自于韩国婴儿的粪便及泡菜中。乳酸杆菌用改良的,MRS,固体培养基，,37,厌氧培养,48h,。从平板中挑取单菌落在纯化的,MRS,固体培养基中培养，并进行革兰氏染色。在,-80,条件下用含,15%,甘油的,MRS,液体培养基储存。传代三次。,2.2 Species level identification,通过,16rDNA,序列分析对,209,个分离菌株进行测定。从每个菌株中提取,DNA,进行引物扩增。,PCR,引物序列如下：正向引物，,5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3;,反向引物,5-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3,；,94,下变性,5min,。然后进行,30,个循环，持续一分钟。退火：,50-55,1min,72,，,40s,聚合反应，最后,72,聚合,5min,。扩增产物使用凝胶提取试剂盒进行纯化。最终产品的序列通过,ABI377 DNA,自动测序仪进行分析。将得到的序列与,DNA,数据库中序列进行比较进行同源性分析。,2.3 pH and bile tolerance,耐酸性：含有,1000,单位,/,毫升的胃蛋白酶的酸化,MRS,液体培养基,37,培养,3h,，观察活菌存活数。,胆盐耐受性：含,0.3%,胆汁的,MRS,液体培养基,37,培养,24h,观察活菌数,2.4 Adhesion assay,HT-29,肠上皮细胞储存于,24,孔培养板中并供给补充,10%,的胎牛血清的,RPMI-1640,，细胞浓度为,4104,个细胞,/,孔。所用细胞浓度大约为约,1107CFU/,毫升。在,37,培育两个小时后，用,PBS,洗涤单层膜,6,次。用无菌水吹打粘附的细菌，使其分离，进行平板计数。重复两次。,2.5 Inhibition of intestinal pathogens,六个代表性的肠道致病菌：大肠杆菌,O157,和,H7 ATCC 43894,，鼠伤寒沙门氏菌,KCCM 11806,，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌和李斯特菌。致病菌在,37,BHI,液体培养基中培养,18h,。取,1ml,细菌培养液与,100ml,含有,1.2%,琼脂的,BHI,一起倒入平板中。将乳酸杆菌（,40,微升）涂在平板的表面，,37,培养,12h,。不含乳酸杆菌的,MRS,作为阴性对照组。培养后，测定抑菌圈的范围。出现明显的超过,2mm,的抑菌圈为阳性。重复三次。,2.6 Lymphocyte proliferation assay,采用,MTT,法。淋巴细胞取自六周龄小鼠的脾脏，将其接种于,96,孔板中，加入,200,微升的,RPMI-1640,（补充,10%FBS,），培养,24h,。将乳酸杆菌加入到每孔中，在,37,含,5%CO2,培养箱中培养。细菌细胞的准备：在,MRS,液体培养基,37C,培养,18,小时后，将细胞悬浮液以,8000r/min,离心,10min,用,PBS,洗涤两次。每个细菌细胞数的调整,6 106 CFU/,毫升。,72h,后，将培养液从每孔移出，并在每孔加入,20,微升的,MTT,溶液。,1h,后，有色甲臜结晶溶解，用酶联免疫检测仪测定,490nm,的吸光度（,OD,值）。重复三次。阳性对照组，淋巴细胞培养在含有刀豆蛋白,A,（,10,微克,/,毫升），植物血凝素（,PHA,，,10,微克,/,毫升）或脂多糖（,LPS,，,10,微克,/,毫升）；阴性对照组：不含乳酸杆菌的的细胞,2.7Determination of interferon(IFN)-gamma production,此实验使用活菌体及热灭活的细菌。活菌体的制备同上，细菌的悬浮液的体积调节,到,105,菌落形成单位,/,毫升。热灭火细胞的制备：,37,MRS,液体培养基中培养,18h,，,8000r/min,离心,10min,用,PBS,洗涤两次。调整细胞悬浮液的体积到,105,菌落形成单位,/,毫升的密度,108,菌落形成单位,/,毫升；最后细胞在,70,热灭活,10min,，在,-20,储存待用。,采用酶联免疫吸附试验（,ELISA,）测定培养上清液中的,IFN-,的水平。从小鼠取出的脾淋巴细胞，将其接种于,96,孔板中，加入,200,微升的,RPMI-1640,（补充,10%FBS,），将细菌细胞加入其中，,37C,在含,5%CO 2,的培养箱中培养。,3,天后，回收培养上清，通过酶联免疫吸附法（,ELISA,）测定,IFN-,释放量。在酶联免疫吸附法（,ELISA,）中，微量滴定板涂覆有,5,微克,/,毫升纯化的抗,IFN-,抗体，室温下反应,4,小时，然后孔板用,PBS,洗涤三次。用,1,牛血清白蛋白（,BSA,）的,PBS,封存。重复三次。孔板在室温下培养,2h,，之后用,PBS,洗涤,5,次。,IFN ,通过生物素标记的抗,IFN-,抗体来测定。将孔板洗涤，加入辣根过氧化物酶。加入,100,微升的盐酸终止反应。在,450nm,处测定,OD,值。对于阳性对照组，淋巴细胞培养在含有刀豆蛋白,A,（,10,微克,/,毫升），植物血凝素（,PHA,，,10,微克,/,毫升）或脂多糖（,LPS,，,10,微克,/,毫升）；阴性对照组：不含乳酸杆菌的的细胞。,2.8 Safety evaluation,在含,5,羊血琼脂平板上培养,48h,后，测定溶血性和菌落形态。明胶液化程度在,25C,冷冻的营养明胶管中测定至少,72h,。,3 Results,3.1pH,值及胆盐耐受性,350,株菌株中有,118,株在含有,1000,单位,/ml,，,pH2.5,的条件下存活。一些菌株能够在胆盐环境中存活,24h,以上。总结起来，共有,59,株乳酸杆菌在酸性及胆盐条件下有较强的存活性。,3.2,粘附力测定,用上述,59,株菌株粘附,HT-29,肠上皮细胞（表,1,）。菌株间的差异性很大。在测试菌株中，有,29,株对上皮细胞有较强的粘附性，粘附性高于或接近阳性对照组鼠李糖乳杆菌。其余,30,株表现出低度或中度的粘附性。,3.3,肠道致病菌的抑制,乳酸杆菌对肠道致病菌的抑制作用有很大的不同。许多的菌数显示出对肠道致病菌有弱的或没有致病性，但是一些菌株，包括发酵乳杆菌,LA12,和,CJMA3,，植物乳杆菌,CJMA1,，,CJLP56,，,CJLP133,，,CJLP243,，,CJNR26,，,CJNR37,，,CJNR54,，,BJ58,，,BJ217,，,BJ224,和,BJ242,能够广泛的抑制肠道致病菌。,MRS,液体培养基对六株肠道致病菌没有抑制作用。,3.4,淋巴细胞增值,MTT,法是一种比色的方法。新分离的脾淋巴细胞与乳酸杆菌共同培养,72h,，细胞的活力采用,MTT,法测定。菌株对细胞活力的影响不同。一些菌株没有活力，而一些菌株可以增加脾细胞的活力（表,1,）。发酵乳杆菌,LA12,，植物乳杆菌,CJMA1,，,CJLP56,，,CJLP133,，,CJLP243,，,CJNR26,和,BJ53,比阳性对照组更能促进脾细胞增殖。,3.5,干扰素（,IFN,）,-,的测定,测定用活菌株和热灭活的菌株感染脾细胞测定产生的干扰素（,IFN,）。分泌的,IFN-,是菌种依赖型的，细菌细胞的浓度范围从,105,到,108,菌落形成单位,/,毫升会诱导产生,IFN-,。植物乳杆菌会诱导比阳性对照组更多的,IFN-,因子的释放。,3.6,安全性评价,基于三个基本测试，所有的测试菌株均是安全的。菌株出现,型或,-,型溶血作用，尿酶活性及明胶液化均显示为阳性。,谢谢！,1,、字体安装与设置,如果您对PPT模板中的字体风格不满意，可进行批量替换，一次性更改各页面字体。,在,“,开始”,选,项卡,中,，点击“,替,换”按,钮右,侧箭,头,，,选,择“,替,换,字,体,”。（如下,图）,在图“替换”下拉列表中选择要更改字体。（如下图）,在“替换为”下拉列表中选择替换字体。,点击“替换”按钮，完成。,22,2,、替换模板中的图片,模板中的图片展示页面，您可以根据需要替换这些图片，下面介绍两种替换方法。,方法一：更改图片,选中模版中的图,片,（,有些图片与其他,对象,进行了组合，,选,择,时,一定要选中图,片 本身，而不是组合）。,单击鼠标右键，选择“更改图片”，选择要替换的图片。（如下图）,注意：,为防止替换图片发生变形，请使用与原图长宽比例相同的图片。,22,赠送精美图标,