基因工程核酸的制备全套ppt.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程第一章核酸的制备,核酸：遗传信息的储存物质,脱氧核糖核酸：,deoxyribonucleic acid,DNA,核糖核酸：,ribonucleic acid,RNA,区别：,1 乙醇（Ethanol）沉淀法；,启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。,2 蛋白酶K（Proteinase K）裂解法：,纯度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡，2550 g/mL（水溶液）；,（1）Taq DNA聚合酶,方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.,标准的PCR反应条件：,模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外有酶催化合成特异性DNA片段。,方法：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,利用设计好的引物，将不同基因，或基因的不同区域连接起来。,5 L（1U/l）,反向PCR 锚定PCR,阴性对照：阴性模板,与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成，20 g/mL（乙醇溶液）；,第一节 天然,DNA,的制备,（,Preparation of DNA,）,一、,DNA,的组成与结构（,Composition and Structure of DNA,）,:,A phosphate group linked by a phosphodiester bond to a pentose(a five-carbon sugar molecule)that in turn is linked to a nitrogen-and carbon-containing ring structure commonly referred to as a“base”.,Base,Pentose,Phosphate Group,Nucleotide,主要碱基的化学结构：,结构：,DNA,DNA,解链温度,（,Tm,，,melting point,）,DNA,分子杂交,(Hybridization of DNA strands from different sources),环状,DNA,（,Circular DNA,）,超螺旋,DNA,（,supercoiled DNA,，,SC-DNA,）；,共价闭合环状,DNA,（,Covalently closed circular DNA,，,cccDNA,）；,开环,DNA,（,open circle DNA,，,oc-DNA,）；,线形,DNA,（,linear DNA,，,L-DNA,）,二、天然,DNA,的提取,（,Purification of DNA,）,(,一,),生物材料的准备（,Preparation of Material,）：,1.DNA,的保存：,的乙醇（,Ethanol,）,溶液（,Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.0,，,EDTA 1 mmol/L,）,1.3.,低温,2.,大肠杆菌（,E.coli,）常见抗生素（,Antibiotics,）的使用：,2.1,氨苄青霉素（,ampicillin,，,Ap,）：,抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，,50,150,g/mL,（水溶液）；,2.2,链霉素（,streptomycin,，,Sm,）：,与细菌核糖体,30S,亚单位结合，抑制细菌蛋白质,(,酶,),的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡，,25,50,g/mL,（水溶液）；,2.3,四环素（,tetracycline,，,Tc,）：,与细菌核蛋白体的,30S,亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基,tRNA,同核蛋白体结合，,5 mg/mL,（乙醇溶液）；,2.4,氯霉素（,chloramphenicol,，,Cm,）：,与细菌核蛋白体,50S,亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成，,20,g/mL,（乙醇溶液）；,2.5,卡那霉素（,knamycin,，,Km,）：,与细菌核蛋白体蛋白基结合，并与较小的,RNA,亚基,编译区的特定碱基结合,，从而抑制蛋白质合成，,25,50,g/mL,（水溶液）；,(,二,),裂解细胞（,Cell lysis,）：,1.,化学方法：,1.1 CTAB,裂解法：,CTAB,（,cetyltriethy ammonium bromide,，十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，与核酸形成复合物，在高盐溶液（,0.7 mol/L NaCl,）中稳定，在低盐溶液（,0.3 mol/L NaCl,）中沉淀。,1.2 SDS,裂解法：,SDS,（,sodium dodecyl sulfate,，十二烷基磺酸钠），阴离子去垢剂，蛋白质变性剂，有效沉淀多糖，与,K,离子形成絮状沉淀，广泛用于质粒（,plasmid,）,DNA,的提取，蛋白质的分离纯化。,2.,酶裂解方法：,2.2,蛋白酶,K,（,Proteinase K,）裂解法：,用于水解蛋白质，特别是与,DNA,结合紧密的组蛋白（,Histone,），广泛用于动物组织基因组,DNA,的提取，通常与,SDS,，,Tris-Cl,及,EDTA,共同裂解细胞。,2.3,溶菌酶（,lysozyme,）裂解法：,通常用于细菌裂解，提取质粒,DNA,，其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，通过低渗透压使细胞胀裂，引起细胞裂解。作用条件温和，,pH 6.0,7.0,，室温,25,。,（三）,DNA,的分离和抽提,1.,酚,-,氯仿抽提法：,苯酚（,phenol,）,-,氯仿（,chloroform,）,-,异戊醇（,isoamyl alcohol,）比例：,25:24:1,，,苯酚：蛋白质变性剂；,氯仿：蛋白质变性剂；并使变性的蛋白质从水相层分离；,异戊醇：防止产生泡沫。,2.,氯化铯密度梯度离心法,(CsCl density gradient centrifugation),；,3.,固相萃取法,(solid phase extraction,SPE),；,离心技术在基因工程中的应用,（,Application of Centrifugation techniques,）,（四）,DNA,的纯化（,purification,）和浓缩（,condense,）,1.DNA,的纯化：,1.1 Rnase,处理，去除,RNA,；,1.2,离子交换层析法；,1.3,氯化铯密度梯度离心法；,1.4,琼脂糖电泳洗脱法；,琼脂糖电泳,（,Agarose gel electrophoresis,）,1.,安放好制胶模具（梳子和胶槽）,2.,琼脂糖凝胶浇灌并冷凝,3.,移走梳子，暴露出上样孔,4.,琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中,5.,上样，通电流，直至,DNA,迁移到适当位置,6.,在紫外光（,UV,）下观察,DNA,电泳情况,DNA,电泳完毕后的琼脂糖凝胶,在紫外光（,UV,）下观察,DNA,电泳情况,不同凝胶的,DNA,电泳情况,琼脂糖凝胶（,agarose,）,聚丙烯酰胺凝胶凝胶（,PAGE,）,电泳仪（电源和电泳槽）,离子交换柱层析纯化,DNA,2.DNA,的浓缩：,2.1,乙醇（,Ethanol,）沉淀法；,2.2,正丁醇（,butyl alcohol,）抽提法；,2.3,聚乙二醇（,PEG6000,）浓缩法；,第三节 人工合成核酸片段,二、核酸的酶法合成,PCR,反应（,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）：,模仿细胞内发生的,DNA,复制过程，在体外有酶催化合成特异性,DNA,片段。,PCR,技术简史,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,PCR,技术简史,1985,年，美国,PE-Cetus,公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,基本原理,是在试管中模拟细胞内的,DNA,复制,最初采用,E-coli,DNA,聚合酶进行,PCR,，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热,DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等因此项技术获诺贝尔化学奖,1.PCR,的基本原理,(Mechanism of PCR),类似于,DNA,的体内复制。,其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的,DNA,得以几何级数倍增。,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上。,（,3,）,PCR,的基本反应步骤,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,PCR,反应,标准的,PCR,反应条件：,10X,缓冲液（,Buffer,）,10,L,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物（,Primer,）各,10,100pmol,模板,DNA,（,Template,）,0.1,2,g,Taq DNA,聚合酶,0.5,2.5U,Mg,2+,1.5mmol/L,PCR,反应,70-75,90-94,37-60,PCR,循环,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,反应,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,37-60,90-95,70-75,PCR,扩增,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,202,20,=1,048,576,302,30,=1.07,X,10,7,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,PCR,反应特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,（,空斑形成单位,）,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,（,1,）,Taq,DNA,聚合酶,（,2,）,Pwo,DNA,聚合酶,（,3,）,Tth,DNA,聚合酶,（,4,）,C.therm,聚合酶,耐热性,DNA,聚合酶,（,1,）,Taq,DNA,聚合酶,1986,年从一种,75,热泉中的细菌,(,Thermus aquaricus,),中分离纯化出来的。,95kDa,，单分子酶，,75,活性最强。,具有,5-3,合成活性和,5-3,外切活性,无,3,-5,外切,活性。,95,时半衰期为,40,分钟,。,启动,PCR,反应的能力很,强，聚合速度快，在,72,的聚合速度为每秒,30-100,碱基。,由于没有,3-5,外切活性，在扩增过程中有,8.9-11x10,-5,的错配率。,（,2,）,Pwo,DNA,聚合酶,来自 古细菌,Pyrococcus woesei,，,由德国宝灵曼公司开发,（,BM,），,90kDa,，,100,的半衰期大于,2,小时，,具有,3-5,外切活性，出错率低,，,使用较多的的且具有高保真度的,PCR,酶。,（,3,）,Tth,DNA,聚合酶,来自嗜热热细菌（,Thermus thermophilus,）,，由,Promega,公司开发成商品。,94kDa,，,95,的半衰期为,20,分钟,。,在,Mg,2+,存在条件下以,DNA,为模板合成,DNA,，而在,Mn,2+,存在下可以,RNA,为模板合成,cDNA,。,因此可在高温下做,RT-PCR,（反转录,PCR,）,反应，避免,RNA,反转录过程中形成的二级结构。,（,4,）,C.therm,聚合酶,来自,Carboxydothermus hudrogenoformans,，,以,Mg,2+,为辅助因子的,逆转录酶,，,最适温度适,60-70,，,同时也具有,3-5,外切酶校对活性,，,用于,RT-PCR,反应。,靶,DNA/,模板,单、双链,DNA,均可。,纯度：,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,使用浓度：,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,其两端,20-30bp,序列用以一对引物的设计。,引物长度,18,30bp,，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。,避免,引物内部或引物之间存在互补序列（,3,个碱基），,避免序列内有较长的回文结构，,减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。,G/C,和,A/T,碱基均匀分布，,G+C,含量在,40,60%,之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。,引物,引物,3,末端碱基应与模板,DNA,严格配对，并且,3,末端为,G,、,C,时引发效率较高。,引物,5,末端,碱基可不与模板,DNA,匹配，可添加与模板无关的序列,(,如限制性核酸内切酶的识别序列、,ATG,起始密码子或启动子序列等,),，便于克隆和表达。,引物用,核酸序列保守区内设计,并具有,特异性,，,引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,原材料,dNTP,脱氧核苷三磷酸,四种,dNTP,浓度应相等,要求：,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,缓冲液,成分：,10 mmol/L Tris-HCl(pH 8,.8,室温下,),，,50 mmol/L KCl,，,1.5 mmol/L MgCl,2,。,Mg,2+,：,是,DNA,聚合酶的激活剂，,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性,循环的温度和时间,温度,:,90-95,模板变性，,复性（,37-60,），,温度由引物长度和,GC,含量决定,；,70-75,引物在模板上延伸,反应时间,变性,30 s,，如果模板,G+C,含量高，变性时间可适当延长。,复性,30 s,。,延伸,1kb 1 min,充足，由扩增产物的大小决定。,循环次数,25,35,次。,25,L PCR,反应体系：,模板,DNA 1,L,（,10,100ng,）,引物,1 1,L,（,10,mol/L,）,引物,2 1,L,（,10,mol/L,）,dNTP,（,10,m,mol/L,）,1,L,（,20 mmol/L,）,10 PCR,反应的缓冲液,2.5,L,Taq,酶,0.5,L,（,1,U/l,）,ddH,2,O,补至,25,L,4.3 PCR,扩增,DNA,片段的方法,常规程序,PCR,反应的程序：,温度（）时间（分钟）,(1)95 3-5,(2)95 0.5,(3)60 0.5,(4)72 1,(5)72 10,25,30,个,循环,PCR,反应的操作注意事项：,1,）加样操作必须在冰上进行；,2,）加样的顺序：,（,1,）从大到小；,（,2,）先加药品再酶,：,PCR,反应结果异常及解决办法：,1,）无带；,2,）杂带多；,3,）,DNA,降解。,PCR,中应注意的事项,防止污染,试剂小量分装,吸头及,EP,管一次性使用,器皿及工作区域要分开，无菌操作,设立对照,：,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,4.4 PCR,技术应用技术的主要类型,反向,PCR,锚定,PCR,不对称,PCR,原位,PCR,RT-PCR,重组,PCR,差异显示,PCR,免疫,PCR,实时定量,PCR,多重,PCR,1),反向,PCR(reverse PCR),方法：,对某个已知,DNA,片段两侧的未知序列进行扩增。,用途：,探索邻接已知,DNA,片段的未知序列；,建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,连接酶,2,）不对称,PCR,(asymmetric PCR),目的：,扩增产生特异长度的单链,DNA,。,方法,：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是,0.010.5M,。,用途,：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组,DNA,结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3,）,RT,PCR:,方法：,以反转录的,cDNA,作模板所进行的,PCR,反应,用途：,测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,克隆,mRNA,的,5,和,3,末端序列,以及从非常少量的,mRNA,样品构建大容量的,cDNA,文库。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR,扩增,4,）多重,PCR,：,在一个反应体系中使用一对以上引物的,PCR,称，其结果是产生多个,PCR,产物，,用于,检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,5,）实时定量,PCR,技术,实时定量,PCR,（也称,TaqMan PCR,FQ-PCR,）是美国,PE,（,Perkin Elmer,）公司,1995,年研制出来的一种新的核酸定量技术，,该技术是在常规,PCR,基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的。,利用设计好的引物，将不同基因，或基因的不同区域连接起来。,6,）融合,PCR,技术,引物（,Primer,）,基因,A,基因,B,技术应用,研究,基因克隆，,分子检测，,DNA,测序，分析突变，,分子进化,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,法医,犯罪现场标本分析,医学,临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控,其他,第四节,DNA,序列测定（,DNA Sequencing,）,一、,DNA,序列测定：,通过各种方法得知,DNA,一级结构各种碱基的排列顺序，是详细分析基因结构和功能的基础。,二、双脱氧链终止法：,利用,DNA,聚合酶合成单链,DNA,模板互补链的性质进行测序。在,dNTP,中掺入一定比例的,ddNTP，,使延伸随机终止，并通过毛细管电泳分离各,DNA,片段。,ddNTP,经,PAGE,分离，描出来的,DNA,的片段,谢谢观看,