流式细胞仪原理.ppt
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- 细胞 原理
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Click to edit Master title style,流式细胞仪,工作原理,EPICS XL/MCL,FC500MCL/MPL,流式细胞术的原理,流式细胞术(,FCM,)是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒(微生物)进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。,FCM,逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。,基本原理,流路,流动室,鞘液,SHEATH,样本流,SAMPLE,单细胞悬液5*10,5,1*10,6,个/,ml,光路,光源,检测信号,光电倍增管,PMT HV,电路,放大电路,HV,及,GAIN,增益,A/D,转换,统计:计算机,流 路,单细胞悬液,大多数仪器是在50-300,m,大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中,这一过程,成为流体动力学聚焦,FLOW CELL,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,光 路,光源,检测信号,散射光信号,FS:,前向角散射光,SS:,侧向角散射光(90度散射光),荧光信号,荧光染料,光学滤片,颜色补偿,电路-光电倍增管,散射光信号前向散射光(,FS),FS-F,orward,(,A,ngel,L,ight),S,catter,在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器,FS,的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及,optical homogeneity,有关,FS,用于检测细胞或其他粒子的表面属性,如:大小,前向散射光,散射光信号 侧向散射光,SS-S,ide,(,A,ngel,L,ight),S,catter,与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器,SS,的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及,optical homogeneity,有关,SS,用于检测细胞内部结构,如:胞浆内颗粒多少,核质比,侧向散射光,90,Degree Scatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,Side Scatter Projection,Light Scatter Gating,Scale,光路-荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.,利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特性,激发波长(,EXCITING),发射波长(,EMISSION),常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长(,nm),发射波长(,nm),用途 颜色,FITC 488 525,免疫荧光 绿色,PE(RD1)488 575,免疫荧光 橙色,ECD 488 620,免疫荧光 橙红,PeCy5 488 675,免疫荧光 红,PI 488 620 DNA,染色,橙红,PECy7 488 755,免疫荧光 深红,PerCP 488 670,APC 633 670,光路-滤片特性,当以,45,o,角,放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光,这种方式的滤片称为二向色性滤片(,dichroic filter),Source,light,Passed,light,Certain colors,absorbed,Absorbance,filter,标准带通滤片,band pass,光源,通过的光谱,630/30 nm,BP,615-645 nm light,Unique 4-Color Single Laser Design,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High Sensitivity,Quartz Flow Cell,Forward Scatter,Detector,Side Scatter,Detector,525,BP FL1(FITC),575,BP FL2(RD1),620,BP FL3(ECD),675,BP FL4(PC5),488,DL,488,BK,550,DL,600,DL,645,DL,PC7,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High Sensitivity,Quartz Flow Cell,Forward Scatter,Detector,Side Scatter,Detector,525,BP FL1(FITC),575,BP FL2(RD1),675,BP(PC5),750BP FL4(PC7),488,DL,488,BK,550,DL,600,DL,700,DL,Optics-Detectors,Photomultiplier tube(PMT),将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号,不同的脉冲信号被转换成数字通道(,CHANNEL),的过程,Single Parameter Histogram:Count,vs,MFI,颜色补偿,各荧光染料发射的荧光信号有重迭,因此要进行色补偿以除去重迭部分,emission intensity,wavelength,FLB,FLA,光谱重叠需进行色补偿,减法颜色补偿,减法补偿,去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误,BD FACSCalibur,补偿试剂,FITC,PE,Correct,Over-comp,FITC,PE,Under-comp,FITC,PE,全矩阵颜色补偿,全矩阵,在每个,PMT,上对于每一个荧光计算“叠加荧光素”的比率,通过矩阵去除或加上信号,EPICS XL,Cytomics FC500,CD45-ECD,EPICS XL,临床科研型流式细胞仪,EPICS XL,合理的光路设计,-单激光激发四色荧光标准模式,确保在同一个细胞上获得最多的信息,EPICS XL,直线光路设计,光损失少,可互换式光学滤片,方便新染料的应用,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High Sensitivity,Quartz Flow Cell,Forward Scatter,Detector,Side Scatter,Detector,525,BP FL1(FITC),575,BP FL2(RD1),620,BP FL3(ECD),675,BP FL4(PC5),488,DL,488,BK,550,DL,600,DL,645,DL,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High Sensitivity,Quartz Flow Cell,Forward Scatter,Detector,Side Scatter,Detector,525,BP FL1(FITC),575,BP FL2(RD1),675,BP(PC5),750BP FL4(PC7),488,DL,488,BK,550,DL,600,DL,700,DL,PC7,With Thanks to Dr.Frank Schnieders,Gentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie,Institut fr Medizinische Biochemie und Molekularbiologie,Universittsklinikum Hamburg-Eppendorf,EGFP,EYFP,and,7-AAD,With EPICS,XL,TM,and,EXPO32,TM,ADC-Software,HEK293,Human Embryonal,Kidney Cells 293,Filter Set,BP 510LAF21,BP 550LAF30,Dichroic Mirror 525DRLP,Cell Viability with 7-AAD,HEK293-cells with EYFP Transfection,HEK293-cells with EGFP Transfection,Mixture of EGFP-and EYFP-transfected HEK293-Cells,EGFP.Enhanced Green Fluorescent Protein(Ex 488;Em 507 nm),EYFP.Enhanced Yellow Fluorescent Protein(Ex 513;Em 527 nm),7-AAD.7-Aminoactinomycin(Viability Stain;Ex 546;Em 647 nm),四色荧光中的补偿,传统补偿与,ADC,补偿,EPICS XL,采用最先进的通讯传输设计,-光纤通讯与数字信号传输,EPICS XL,中的,PRISM,功能-将多张直方图浓缩在一张上,Howard M.Shapiro,Practical Flow Cytometry,3,rd,ed.,page 355,“The XL is presently unique among production flow cytometer in its use of,digital electronics for transformation,between linear and logarithmic signals and of,computer algorithm for fluorescence compensation,.I have already praised this approach a few times(pp.19,166,189),while also nothing that it probably represented the only practical way to implement another feature which presently distinguishes the EPICS XL from its competitors,i.e.,4-color fluorescence analysis.,Both features will have the other manufacturers trying to play catch-up for a while.,”,“XL,因為有全數,字,化的線性-數轉換及電腦軟體螢光補償而成為現今流式細胞分析儀系統中最獨特的產品.個人也多次表示欽佩(第19,166,189頁).,EPICS XL(,單一,激光,產生)的四個螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕”.,摘自”流式細胞分析儀系統實務第三版,1995.”作者,Howard M.Shapiro,Practical Flow Cytometry,3,rd,ed.,page 355,专家评述,来自,ISAC,的报告,产品介绍,XL,设计的所有优势:,单激光激发四色荧光,光纤通讯,数字化信号传递,可互换式光学滤片,无需调整光路,具有620,nm,的滤片,最适合,DNA,倍体分析,利用软件进行全矩阵优化(,ADC),颜色补偿,PRISM,浓缩柱形图,快速调节电压,快速调整补偿,补偿向导,利用生物样本进行颜色补偿,WINDOWS,界面操作软件,Cytomics FC500,MCL,进样,MCL,自动模式.,MCL,直接(,或手动),模式.,单管固定位置进样.,可以暂停/旋转以方便随时添加刺激剂等,条码识别,样本混匀,产品介绍:硬件,产品介绍:硬件,可选,MPL(,研究用),24,孔,每孔样本体积0.5 2.5,ml,96,孔,最少体积200,ul,40,管(12,x75mm),最少体积500,ul,固定样本体积,吸样25,ul,样本混匀功能,FC500,特点,1,根激光同时激发5色荧光,2,根激光可选,3,种进样方式,4,种直方图分辨率,5,色荧光同时检测,全球第一台单激光激发五色荧光的流式细胞仪,全球唯一一台获得,Quality leadership Award,的流式细胞仪,全球唯一一台获得,IBO,设计大奖的流式细胞仪,全数字化流式细胞仪,全自动软件操作,全面兼容,LIS,系统,全自动进样系统,全面广泛的临床及科研应用,临床应用,淋巴细胞亚群分析,白血病和淋巴瘤的免疫分型,肿瘤的细胞周期和倍体分析,网织红细胞计数,细胞移植的免疫状态监测,造血干细胞计数,阵发性血红蛋白尿,HLA-B27,检查,血小板功能及相关疾病,HIV,免疫分型,,CD4,绝对计数,免疫功能研究(淋巴细胞亚群分析、细胞活化、细胞因子),磷酸化蛋白的检测,干细胞研究,/,树突细胞研究,细胞功能研究(细胞内,PH,值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位),血小板分析(心脑血管疾病),肿瘤相关基因表达的研究,抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究,细胞周期和倍体分析,细胞凋亡及凋亡相关蛋白,转染,&,基因沉默效率检测,细胞分选、分选后培养及相关生物学研究,科研应用,谢 谢,展开阅读全文
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