流式细胞学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,流式细胞学,血液科,流式细胞仪检测原理,1.,激光光源及光束形成系统,：,激光光源：,常用的是氩离子,(488nm)和,氦氖离子（633,n,m,）,气体激光管,；,一般选配2-4根激光，488nm、,633nm和355nm、407nmUV激光,。,最多检测13个荧光参数,。,2.光学系统：由若干组透镜、小孔、滤光片组成。滤光片分长通（LP）、带通（BP）、短通（SP）、二向,滤光片,，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管；,3.信号检测系统：在激光检测区产生散射光和荧光信号；由光,电倍增管(PMT),：将,荧光信号转换为电信号，并将信号放大,，通过计算机处理得到结果。,流式细胞仪检测原理,前向角散射光,（,FSC,）：角度接近0度，,反映,细胞,体积,大小,，但受细胞折射率影响，如细胞不是球形时（精子、红细胞）变化大；,侧向角散射,（,SSC,）：角度接近90度，反映,细胞内相对复杂性,，主要是,细胞,内颗,粒的性状,和,核膜的折射率,。,结果显示：,单参数直方图,，,双参数二维点图,，,等高图,，,二维密度图,，,三维图,。,流式细胞仪检测原理,荧光染料,标记：常用,FITC(异硫氰酸荧光素）,和,PI(碘化丙啶）,。,荧光信号：,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关,。,原理：物质吸收一定波长的光后会发出更长波长的光。荧光信号可反映膜抗原、受体、DNA等相对数量。光源的激发波长尽可能接近染料的激发光谱峰值（吸收光波长），但发射波长（荧光波长）必须不同。因每个荧光检测器只检测特定波长的荧光信号。,荧光,染料,种类,FITC,(异硫氰酸荧光素）,：,492nm,；,530nm,绿色,PE,（藻红蛋白）,：,480nm；,575nm,；,橙黄色,PerCP,(多甲藻黄素叶绿素蛋白）,：,490nm；,67,5,nm深红色,PI,(碘化丙啶）,：,493nm；,620nm橙红色,APC(别藻兰蛋白）：,650nm；,660nm红色,鞘液流动室,光散射原理示意图,光散射检测原理,Fluorescence,FALS Sensor,Fluorescence detector,外周血白细胞分类,二维点图分析,FCM应用,1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析,2、凋亡检测,3、免疫功能的检测,4、,血液学应用,5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。,6、其他：溶液中细胞因子的测量。,7、细胞分选,流式细胞术的,血液学,应用,白血病免疫分型,淋巴细胞亚群,造血干细胞计数：造血干细胞移植,网织红细胞,PNH诊断（CD55、CD59）,血小板活化试验,AL免疫表型检测意义,鉴别淋髓系列,；,区分亚型,；,双表型、杂合型,；,Mo、M7,；,提示细胞遗传学异常,；,部分与预后相关,；,MDR监测,。,设门,通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。设门策略不是统一的，要根据样本特征的变化而变化。,FSC/SSC,：,不能将淋巴、幼稚,、有核红细胞,及单核细胞区分开,。但,FSC/SSC,设门可去除碎片干扰。,CD45/SSC,：,CD45是,白细胞,抗原,，,RBC,、,PLT为阴性。CD45在成熟细胞表达强，幼稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞表达强度不同。优点：能将淋巴单核及幼稚细胞区分开，特异分析白血病细胞免疫表型。,设门,当异常细胞不多时，熟悉细胞的免疫特性帮助准确设门：,CD45：淋巴细胞高表达，有核红细胞、有时原始细胞、浆细胞不表达；,CD19的出现是B细胞定向发展的信号，和CD20在各阶段均有；,CD5+B细胞高表达见于90%慢性淋巴细胞白血病；,CD10提示B细胞来自生发中心，偏幼稚；CD79a/b与免疫球蛋白相关，提示B细胞偏成熟；,正常骨髓细胞CD45/SSC和FSC/SSC图,正常骨髓细胞CD45/SSC和FSC/SSC图,R2：淋巴细胞；R3：幼稚淋巴细胞+幼稚髓细胞；R4：粒细胞（中晚幼粒+成熟中性粒+嗜酸性粒）R5：单核细胞；R6：有核红细胞。,CD45荧光强度：淋巴细胞、单核细胞嗜酸性粒细胞中性粒细胞红细胞、浆细胞；较成熟细胞幼稚细胞；,SSC：嗜酸性粒细胞中性粒细胞单核细胞、幼稚髓细胞淋巴细胞、有核红细胞。,白血病流式特点,AL免疫表型特点:紊乱表型,1.系列交叉:AML表达CD2,CD19,；,2.,表达不同步:早期与晚期抗原同时表达,；,3.表达量异常,：过表达或低表达；,4.与细胞大小不匹配:如大CD2+细胞或小CD13+细胞,。,正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血病细胞免疫标志特点,常用各系血细胞CD抗原,1、T系：CD1-CD8,（CD6,不用）,2、B系：CD10,CD19-CD24,FMC7,3、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD64,4、干祖：CD34,CD117,CD38,HLA-DR,正常B细胞标志,B-ALL的分型,正常T细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类,T-ALL的分类,正常单核细胞标志,全单核细胞标志：CD33,CD13,HLA-DR,幼稚单核细胞标志：CD34,CD117,成熟单核细胞标志：CD14,CD64,正常粒细胞标志,成熟粒、单核细胞主要区别,成熟粒细胞：,CD33+HLA-DR-CD14-CD64+dim,成熟单核细胞：,CD33+HLA-DR+CD14+CD64+,诊断白血病主要标志：,B-ALL:,CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79a,T-ALL:,CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3,AML:,CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO,M3:,CD34,（,-,）,HLA-DR,（,-,），淋系（-），单核（-）,M2:,CD19+:t(8,21),M4/M5:CD14+,M6:GlyA+,CD71+,M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+,双表型急性白血病诊断的积分系统(EGIL,1998),.,.,流式常见图形,(Dot Plot),散点图适用于：多参数分析,流式应用常见范围,细胞大小,细胞的颗粒度,细胞表面分子：CD 系列,细胞浆内分子：胞内细胞因子,细胞核内分子：P53,细胞功能检测：细胞周期、凋亡,其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）,