第三章-高效液相色谱法.ppt

单击此处编辑母版样式,单击此处编辑幻灯片母版样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,*,第三章 高效液相色谱法,(High Performance Liquid Chromatography,，,HPLC),3.1 概述,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术(不挥发有机物约占70%)，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，,引入了气相色谱的理论,，在技术上,采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。,为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,1,高效液相色谱仪,2,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段,柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀,常压输送流动相,柱效低（H，n）,分析周期长,无法在线检测,2HPLC：分离和分析,柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）,高压输送流动相,柱效高（H，n）,分析时间大大缩短,可以在线检测,3,离线分析在时间上有滞后性，得到的是历史性分析数据，而在线分析得到的是实时的分析数据，能真实地反映生产过程的变化，通过反馈线路，可立即用于生产过程的控制和最优化。离线分析通常只是用于产品（包括中间产品）质量的检验，而在线分析可以进行全程质量控制，保证整个生产过程最优化。在线分析是今后生产过程控制分析的发展方向。,4,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测,主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象,GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，,高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及,高聚物的样品不可检测,占有机物的20%,HPLC：溶解后能制成溶液的样品，,不受样品挥发性和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子,和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的80%,5,2流动相差别,GC：流动相为惰性气体,组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用,HPLC,：,流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用,流动相种类较多，选择余地广,流动相极性和,pH,值的选择也对分离起到重要作用,选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相,可以增大分离选择性,3操作条件差别,GC：加温操作,HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,6,3.2 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的结构示意，一般可分为4个主要部分：,高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。,此外还配有,辅助装置,：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,9,液相色谱中采用梯度洗脱，目的：缩短分离时间；提高分离效果。,梯度洗脱,：让流动相的组成随时间而改变，以调节流动相的极性、离子强度或pH，使样品组分的相对保留值得以改变，从而提高分离效率。,梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度,梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。,优点：,分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。,缺点：,检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。,10,溶剂A,溶剂B,电磁阀A,电磁阀B,混合室,泵,溶剂A,溶剂B,高压泵A,高压泵B,混合室,低压溶剂梯度方框图,高压溶剂梯度方框图,梯度洗提流程,11,应用举例,12,一、液相色谱仪,13,流 程,14,由于高效液相色谱所用,固定相颗粒极细,，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有,高压输液系统,。它是,高效液相色谱仪最重要的部件,，一般由,储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成,，其中,高压输液泵是核心部件,。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。,常用的输液泵分为,恒流泵,和,恒压泵,两种。,恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关,；,恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点,。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,1.高压输液系统,15,在液相色谱中,为什么对所用的流动相进行脱气处理?,答,防止在检测器流动池内释出气泡产生干扰信号,溶解在流动相中的氧有可能与固定相或试样发生反应。,16,2进样系统,进样阀,17,18,19,3.分离系统色谱柱,色谱柱,是液相色谱的,心脏部件,，它包括,柱管,与,固定相,两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长,530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。,一般在分离前备有一个,前置柱,，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。,20,常用分离柱,柱体为直型不锈钢管，见下图,柱子装填得好坏对柱效影响很大,。对于细粒度的填料（20m）一般采用,匀浆填充法,装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,21,4.检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。,一类是溶质性检测器,，它仅对,被分离组分,的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有,紫外、荧光、电化学检测器等,。,另一类是总体检测器,，它对,试样和洗脱液,总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有,示差折光，电导检测,器等。现将常用的检测器介绍如下:,22,1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质,2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质,灵敏度高,3）示差折光检测器：利用折光率的差别,灵敏度低,温度要求严格。,几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此示差折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10,-7,gcm,-3,。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。,4）电化学检测器,5）化学发光,23,紫外可见光、电化学检测器的流通池比较,24,1).紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。,特点,：,选择性检测器，如芳烃类化合物的检测；灵敏度高，可检测10,-9,g/mL的物质；线性范围宽，10,4,-10,5；,对温度及流动相的改变不敏感；适合梯度洗提；HPLC常规检测器。,分类,：,（1）固定波长的紫外检测器,（2）可变波长的紫外检测器,（3）二极管阵列检测器,25,2).荧光检测器,（fluorescence detector）,特点：选择性检测器，如PAH，蛋白质；高灵敏度，比紫外高约1000倍；适合梯度洗提。,对对称结构的多环芳烃，维生素,B,、,黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应,.,26,3).示差折光检测器,（differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。,特点：通用性检测器（每种物质具有不同的折光指数）；低灵敏度；基线易受温度的影响；不适合梯度洗提。,分类：偏转式、反射式和干涉型三种；,27,示差折光检测器光路,28,4).电导检测器,其作用原理是根据物质在某些介质中离解后所产生的电导变化来测定离解物质含量。,特点：选择性检测器，对离子型化合物有响应；灵敏度高；受温度的影响；不能梯度洗提,29,5）几种检测器特性比较,示差折光,紫外,荧光,电导,应用范围,通用,选择性,高选择性,选择性,可否梯度淋洗,不可,可,可,不可,线性范围,10,4,10,5,10,3,10,4,最小检测量,g,ng,pg,ng,对温度敏感度,敏感,低,低,敏感,溶剂使用情况,无限制,受限制,受限制,受限制,30,二.柱外效应,高效液相色谱柱比气相色谱柱,短,得多（约,530 cm,），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括,进样系统、连接管道及检测器中存在死体积,。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此,高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,31,3.3高效液相色谱的固定相和流动相,（）固定相,高效液相色谱固定相以,承受高压能力,来分类，可分为,刚性固体,和,硬胶,两大类。,刚性固体,以,二氧化硅为基质,，可承受7.010,8,1.010,9,Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。,如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相,，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。,硬胶,主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由,聚苯乙烯与二乙烯苯基,交联而成。可承受压力上限为3.510,8,Pa。,固定相按,孔隙深度,分类，可分为,表面多孔型和全多孔型固定相两类。,32,1.表面多孔型固定相,它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。,表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。,这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。,33,2全多孔型固定相,它由直径为10nm的,硅胶微粒凝聚而成,。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。,这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.,34,35,（二）流动相,由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：,（1）溶剂对于待测样品,，必须具有合适的极性和良好的选择性。,（2）溶剂要与检测器匹配,。,对于紫外吸收检测器,，应注意选用,检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长,。,所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收,，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。,对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相,，以达最高灵敏度。,36,37,（3）高纯度,。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。,不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。,痕量杂质的存在，将使截止波长值增加501OOnm。,（4）化学稳定性好,。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。,（5）低粘度,。,若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。,常用的低粘度溶剂有,丙酮、乙醇、乙腈,等。,但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.,38,3.4,高效液相色谱法的主要类型及选择,（）液一液分配色谱法（LLPC）,在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。,1分离原理,液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，,都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。,所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。,39,2.固定相,由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液,，一氧二丙睛,，中等极性的,聚乙二醇,，非极性的,角鲨烷,等。,为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了,化学键合固定相,。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，,可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破,。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。,40,3流动相,在液液色谱中为了避免固定液的流失。,对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好,。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为,正相分配色谱,和,反相分配色谱,。如果采用,流动相的极性小于固定相的极性,，称为,正相分配色谱,，它适用于,极性化合物,的分离。其,流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出,。如果采用,流动相的极性大于固定相的极性,，称为,反相分配色谱,。它适用于,非极性化合物,的分离，其,流出顺序与正相色谱恰好相反。,41,（二）化学键合相色谱法,采用,化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。,由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。,1键合固定相类型,用来制备键合固定相的载体，几乎都用,硅胶,。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类,（1）,疏水基团,如不同链长的烷烃（C,8,和C,18,）和苯基等。,（2）,极性基团,如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。,（3）,离子交换基团,如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；,作为阳离子交换 基团的磺酸等,.,42,2.化学键合固定相类型,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；,a.硅氧碳键型：,SiOC,b.硅氧硅碳键型：,SiOSi C,稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广,；,c.硅碳键型：,SiC,d.硅氮键型：SiN,43,3键合固定相的制备,（l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：,Si0HROHSiORH,2,0,由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅,适用于不含水或醇的流动相。,（2）SiC或Si一N共价键合固定相,制备反应如下,44,共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在48范围内.,45,（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相,制备反应如下：,这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，pH=28范围内正常工作，应用较广泛.,46,4.化学键合固定相的特点,（1）,传质快,，,表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；,（2）,寿命长,，,化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；,耐水、耐光、耐有机溶剂，,稳定,；,（4）,选择性好,，,可键合不同官能团，提高选择性；,（5）,有利于梯度洗脱；,存在着,双重分离机制,：,(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,47,5.,正相键合相色谱法,此法是以极性的有机基团，CN、NH,2,双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。此时，,组分的分配比k值随其极性的增加而增大,，,但随流动相极性的增加而降低,。,这种色谱方法主要用于分离,异构体、极性不同,的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,48,6,反相健合相色谱法,此法的,固定相是采用极性较小的键合固定相,，如硅胶一,C,18,H,37,、硅胶一苯基等；,流动相是采用极性较强的溶剂,，如甲醇一水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等,低极性,化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。,P,94,图形（a）和（b）,49,关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓,疏溶剂,作用理论来解释。这种理论把,非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，,这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，,一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用（见图20-5）。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。,50,51,对极性吸附和正相色谱，P与k的关系可大用下式表示：,k,2,/k,1,=10,(P1-P2)/2,对于反相色谱：,k,2,/k,1,=10,(P2-P1)/2,52,什么是色谱的键合固定相?它与机械涂布的固定液有什么不同?,（1）通过化学反应将有机分子键合到载体表面，形成吸附和分配机理兼有的固定相称为键合固定相。,（2）键合固定相的有机分子是通过化学反应结合到载体表面，克服了固定液涂渍不均衡和流失等问题。固定液只涉及到分配平衡机理，而键合固定相吸附和分配平衡机理兼有。,53,7.,离子性键合相色谱法,当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO,3,H 一CH,2,NH,2,、C00H、一CH,2,N（CH,3,）等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其,分离原理与离子交换色谱类同。,以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有8O的分离问题是用键合相色谱法解决。,此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系,。如何根据样品极性种类来选择化学键合的固定相，请参看表20-3。,54,55,（三）液一固吸附色谱法(LSAC),液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。,液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。,1分离原理,当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:,X+nS,ad,=X,ad,+nS,56,达平衡时,有,其中,K,ad,为吸附平衡常数,，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。K,ad,值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。K,ad,值可通过吸附等温线数据求出。,57,2,固定相,吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。,在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是,全多孔型微粒填料。,58,3.,流动相,一般把吸附色谱中,流动相称,作,洗脱剂。,在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（,0,）来衡量。,0,越大，表示洗脱剂的极性越强。表20-4列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的,0,值。在硅胶吸附剂中,0,值的顺序相同，数值可换算（,0,硅胶,=077,0,氧化铝）。,59,60,(四）离子交换色谱法（IEC）,此法是利用,离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法,。凡在溶液中能够,电离的物质,，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,61,1离子交换原理,离子交换色谱法是,利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的,。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：,阳离子交换：,阴离子交换：,一般形式：R一AB RBA,62,达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：,式中A,r,，B,r,分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：K,B/A,越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，,B离子电荷越大，水合离子半径越小，K,B/A,值就越大。,63,对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的K,B/A,按以下顺序：,Cs,+,Rb,+,K,+,NH,4,+,Na,+,H,+,Li,+,二价离子的顺序为：,Ba,2+,Pb,2+,Sr,2+,Ca,2+,Cd,2+,Cu,2+,，Zn,2+,Mg,2+,对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：,ClO,4,-,I,-,HS0,4,-,SCN,-,NO,2,-,Br,-,CN,-,Cl,-,BrO,3,-,OH,-,HCO,3,-,H,2,P0,4,-,IO,3,-,CH,3,COO,F,2固定相,作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见表20-5）,64,65,常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：,（,l）多孔型离子交换树脂,它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分.,（,2,）薄膜型离子交换树脂,它是在直径约对30m的固体情性核上，凝聚12m厚的树脂层.,66,（3）表面多孔型离子交换树脂,它是在固体惰性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂.,（4）离子交换键合固定相,它是用化学反应将,离子交换基团键合到惰性载体表面,。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。,67,3,流动相,离子交换色谱法所用流动相大都是,一定pH和盐浓度,（或离子强度）,的缓冲溶液,。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。,68,关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，,只要电离度增大，就会使样品的保留增大。,69,（五）离子色谱法（IC）,离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。,由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根,抑制柱,，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。,通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。,这种色谱技术称为离子色谱,。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：,70,R,+,OHH,+,Cl,-,-R,+,Cl十,H,2,O,R,+,一OH,-,M,+,Cl,-,-,M,+,OH,R,+,Cl,-,由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M,+,转变成相应的碱，由于OH,-,离子的淌度为Cl,-,离子的2.6倍，提高了所,测阳离子电导的检测灵敏度,。对于阴离子样品也有相似的作用机理。,在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为,抑制型离子色谱或称双柱离子色谱,。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了,电导率极低的溶液,，例如110,-4,510,-4,moldm,-3,苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。,71,（六）离子对色谱法（IPC）,离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法,。它是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物。在20世纪7O年代中期，Schill等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展。,离子对色谱法原理,离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。,关于离子对色谱,机理，至今仍不十分明确，,已提出三种机理：,离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理,。现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A,-,相反的离子B,+,，B,+,离子由于静电引力与带负电的组分离子生成离子对化合物A,-,B,+,。离子对生成反应式,72,由于离子对化合物,A,-,B,+,具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。,73,根据上两式，有,式中,为相比率,。容量因子k随K,AB,和B,+,水相,的增大而增大。,键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛.,74,（七）尺寸(空间)排阻色谱法,尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，,主要用于,较大分子的分离,。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是,基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。,尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：,（1）,保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。,(2),保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器,（3）,固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。,（4）,不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。,75,1分离原理,尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其,固定相为化学惰性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大,。凝胶内具有一定大小的孔穴，,体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。,这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图20-7。,76,分离原理示意图,77,2固定相,排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。表20-6列出了常用的一些固定相。,所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。,（1）软性凝胶,如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。,（2）半刚性凝胶,如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。,（3）刚性凝胶,如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm,3,s,-1,；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。,78,3流动相,排阻色谱所选用的,流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶,。当采用软性凝胶时，溶剂也必须,能溶胀凝胶,。另外，,溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果,。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。,选择溶剂还必须与检定器相匹配,。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。,79,应用,大分子的分离分析,聚合物分子量分布的测定,1.,聚乙二醇40000 2.聚乙二醇10000,3.聚乙二醇3000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇,80,(八)亲和色谱法（AC）简介,亲和色谱是利用,生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力,，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓,间隔臂,（如环氧、联氨等）；随后，再连接上,配基,（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。,81,82,（九）分离类型的选择,1根据相对分子质量选择,相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是40O2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。,2根据溶解度选择,弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采液-固吸附色谱；等等,83,表,3,-,7液相色谱分离类型选择参考表P,93,溶于水排阻色谱，水为流动相,相对分子质量,2000 不溶于水排阻色谱，非水流动相,同系物分配色谱,不溶于水 异构体吸附色谱,样品 分子大小差异排阻色谱,反相液一液色谱,相对分子质量 溶于水，不离解,2000 排阻色谱，水为流动相,碱阳离子交换色谱,溶于水，可离解,酸阴离子交换色谱,溶于水，,离子与非离子反相离子对色谱,84,用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。,3根据分子结构选择,用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。,现列出表20-7作为选择分离类型的参考。,85,选择合适的分析条件,样品的,预处理,方法,色谱柱,流动相,检测器的种类及条件（波长等）,86,(十)HPLC的应用,application of HPLC,1.环境中有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅胶(37 50,m),流动相：正己烷,流 速：1.5 mL/min,色谱柱：50cm,2.5mm(内径),检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,87,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相,流动相：20%甲醇-水 100%甲醇,线性梯度淋洗，2%/min,流 速：1mL/min,柱 温：50,C,柱 压：70,10,4,Pa,检测器：紫外检测器,88,思考题,1现需分离分析一氨基酸试样，拟采用哪种色谱？,2提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？,3.何谓反相液相色谱？何谓正相液相色谱？,4.在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？,5.在液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽 略不计？(p369),6.对下列试样，用液相色谱分析，应采用何种检测器：,（l）长链饱和烷烃的混合物 （2）水源中多环芳烃化合物。,7.对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析，应采用哪一种液相色谱法？,8什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？,9什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？,10.指出下列各种色谱法，最适宜分离的物质。,（l）气液色谱；(2)正相色谱；（3）反相色谱；（4）离子交,换 色谱;（5）凝胶色谱；(6）气固色谱；(7）液固色谱。,89,