生物电子传感器.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Application of Real-Time Cell Electronic Sensing(RT-CES)Technology to Cell-Based Assays,将实时细胞电子传感技术,(RT-CES),应用到细胞检测中,李雪莹,41113107,介绍,材料和方法,RT-CES,系统,细胞培养,实验材料,数据分析,结果和讨论,RT-CES,的原理,细胞增长率的测量,LTK,细胞的 毒性和保护作用,细胞有丝分裂抑制因素的实验,A2780,细胞凋亡的感应,总结,Introduction,随着基因组学和蛋白质组学的快速发展，人们找到了更多的基因靶点以用于药物治疗，这导致了对新型药物需求的快速增长。这就需要一种可以快速高效地找到治疗靶点对应化合物的检测方法。包含对信号分析、通路分析、离子通道分析、细胞成像分析的细胞功能性检测已经成为寻找新型药物的首选。,普通的筛选细胞实验用示踪物（放射性同位素、光吸收、荧光、冷光标记等）来检测多种细胞功能，但这种方法不仅费时，还增加了实验复杂程度，干扰性也增加。近几年兴起的无标记检测技术（应用,比色共振反射,来直接测量细胞相互作用；测量细胞光、声方面的移动性来进行,optophoresis,细胞分析；基于细胞基质阻抗测量 的电子测量）。,比色共振反射：普通荧光分光光度仪研究卟啉在核酸分子上的,J,型堆积时会产生的增强的光散射信号。,optophoresis,细胞分析：,optophoresis,是一种非侵入性的细胞分析技术是基于活全细胞与光学梯度域的相互作用，通常产生的近红外激光。,无标记检测的潜在好处在于同一的实验条件、无创伤性测试且实时收集信息量大、外部条件干扰少。先介绍,electrical cellsubstrate impedance,sensing,电子细胞基质阻抗传感,(ECIS),。,传统的,ECIS,系统中，一个大面积参考电极和一个或多个小的检测电极,(,小于,0.1%,底面积,),固定在细胞培养皿底部。通过测量参考和检测电极之间的阻抗的变化可以实时监控细胞的粘附、分离、扩散、微移动。虽然这样有很多优点，但它也有一些缺点：,只有一小部分细胞在监控范围，很多细胞的变化都检测不到。,ECIS,系统只有八个检测培养皿孔却有很大面积的参考电极，这对未来规模化发展不利。,RT-CES系统,三大构成：电子传感器分析仪，装备站，,16,孔培养皿板,circle-on-line,电极排列,玻璃面的处理增加细胞在培养皿孔上的粘附强度,培养皿板在装备站上，装备站通过电线连接电子传感分析仪，在,RT-CES,软件的操作下记录和处理实验数据。,16,孔培养皿板的底部微电极阵列。每个检测区域的面积是,19.6,平方毫米,检测区域的直径是,5,毫米,外部用于测量阻抗的电子传感器分析仪电极用的是,10-mV,交流电压。,左边是裸电极等效电路，包括电解质电阻溶液的电阻和溶液,/,电极界面的阻抗。,右边是细胞粘附后的电极等效电路，细胞等效为电容和电阻的并联。,细胞培养,所有细胞：湿润的保温箱，,37C,5%,CO2,，,10%,胎儿牛血清，,100 g/ml,盘尼西宁,/100 units/ml,链霉素,U2OS,人骨肉瘤细胞：,McCoy,媒介加左旋谷酰胺,A2780,人卵巢癌细胞：,RPMI,加,10 g/ml,胰岛素,LTK,鼠成纤维细胞：,2 m,M,谷氨酸盐，,1 mg/ml G418,（抗生素），,10 n,M,地塞米松（抗炎药），地塞米松受体的抑制剂,细胞先在室温下培养,15,分钟再放入,RT-CES,恒温箱,实验材料,微孔板荧光检测仪,组织培养皿,盐酸阿霉素,紫杉醇,数据分析,用,Prism,软件,（,GraphPad Prism,是一数据分析和作图软件,带有基本的生物数理统计,曲线拟合,及图表显示等功能,适用于生物数理统计实验的数据处理,）进行数据的非线性回归分析。,Results and Discussion,RT-CES的原理,在没有细胞时，可以检测到一个初始阻值；,一个细胞贴附到电极表面，阻断了部分电路中通过的电流,导致电极阻抗的增加；,多个细胞附着在电极表面,进一步减少电流,导致多重增加阻抗。,RT-CES的原理,随着时间的推移,细胞在电极上增殖，大量的细胞贴附上电极,使得细胞可以相互连接得更紧密、分布到更远，从而使的电极阻抗快速增加,。,RT-CES的原理,一个参数称为细胞指数,(CI),派生的代表基于电阻抗测量细胞状态,N=3 for 10 kHz,25 kHz and 50 kHz,；,R,0(,f,)and,R,cell(,f,),分别表示没有细胞或有细胞时的测量阻值。,几个特征：,1,、如果没有细胞或细胞没有贴附在电极上，,CI=0,；,2,、在相同条件下，细胞贴附得越多，,CI,值越大；,3,、细胞贴附数量一定时，改变细胞的状态可以引起,CI,值的改变。,细胞增长率的测量,A,图是传统标记测量技术和,RT-CES,技术对细胞活性的影响对比。接种后,72h,的结果。,B,图是对比细胞增长速度，在接种,5000cells/well,后,24h,48h,72h,的测量结果。,C,图是比较在细胞融合和过融合状态下两种测量方法。接种,10000cells/well,白色代表,RT-CES,技术。,LTK细胞的毒性和保护作用,40000cells/well,，,24h,后添加一号化合物对诱导细胞的影响,1,微,M,(red square),0.3,微,M,(green triangle),0.1,M,微,(blue circle),0.03,微,M,(pink X),0.01,微,M,(orange open square),no compound(black),B,图表示在,24(,方块,),36(,三角,),and48(,圆,)h,后加入一号化合物的计量反应曲线。,C,图表示,72h,后一号化合物和二号化合物在两种测量方法下的测量结果。白色表示,RT-CES,技术。,细胞有丝分裂抑制因素的实验,A,图是,24(,方块,),36(,圆,),48(,三角,),and 60(,X,)h,之后加入紫杉酚对,U2OS cells,的影响。,B,图是,24(,方块,),36(,圆,),48(,三角,),and 60(,X,)h,之后加入三号化合物对,U2OS cells,的影响。,C,图是用两种方法观察,72h,后三号化合物对细胞的有丝分裂阻断活动。白色代表,RT-CES,A2780细胞凋亡的感应,A,图是,24(,方块,),36(,圆,),48(,三角,),and 60(,X,)h,之后加入阿霉素对,A2780 cells,的影响。,B,图是,24h,后添加化合物对细胞的影响,300 n,M,(red triangle),100 n,M,(green circle),30 n,M,(blue cross),3 n,M,(purple open square),1 n,M,(orange opencircle),no compound(black),C,图是,72h,后四号化合物对,A2780,细胞凋亡的影响，用两种测量方法。白色的是,-CES,技术。,Conclusion,基于电阻抗测量的,RT-CES,系统对于细胞检验来说是一个无标记和简单同一的操作。,RT-CES,系统中,CI,的数值反映了细胞生长速率和细胞增殖,这种方法得到的结果与传统方法相近但可以得到动态的数据。此外,RT-CES,系统还可以确定细胞毒性,细胞保护作用,细胞生长抑制,细胞凋亡。从,RT-CES,系统获得的动态数据还可以缩短实验时间、提供大量数据，因此，应用,RT-CES,系统能够简化细胞实验步骤和缩短实验时间。,The End,