核酸杂交医学知识课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,第一节 核酸分子杂交的基本原理,第二节 核酸探针,第三节 核酸分子杂交技术,第一节,核酸分子杂交的基本原理,DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间，只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。,根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。,第二节 核酸探针,核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。,一、核酸探针的类型,基因组DNA探针,用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子)。,cDNA探针,与mRNA互补的DNA链称,cDNA，,特异性高，是一种较理想的核酸探针。,RNA探针,RNA探针有下述优点：,杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更高。,RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性，杂交效率较高。,RNA无高度重复序列，非特异杂交少。,杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂交本底。,寡核苷酸探针,寡核苷酸探针是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工合成的。,1.探针制备方便，可以根据需要设计合成各种寡核苷酸片段，从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选特定的克隆。,2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱变技术产生的点突变。,3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针。,二、标记物,标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性。,放射性同位素,放射性同位素探针标记物，有高度特异性，缺点是易造成放射性污染，半衰期较短，不能长期存放。常用的有,32,P、,3,H、,35,S，有时也用,14,C、,125,I或,131,I。,非放射性标记物,(1),半抗原:如生物素,地高辛等,(2),配体,(3),荧光素:罗丹明等,(4),化学发光技术,三、探针放射性同位素标记法,放射性同位素的选择,32,P、,35,S或,3,H均可用于标记DNA或RNA。,32,P最常用于核酸的标记。,35,S适用于原位杂交和DNA序列测定。,3,H放射比活度低，故常用于原位杂交。,核酸探针的标记方法,缺口平移法(图7-1),大肠杆菌DNA聚合酶I具有5,3DNA聚合酶活性，以相对应的链为模板，从切口处3-OH端逐个加入新的核苷酸，此酶还具有5,3外切核酸酶活性，可从切口的5端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如,-,32,P dNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置换原有的核苷酸，制备出核素标记的DNA探针。缺口平移法适用于标记大于1 kb的双链DNA。,随机引物法(图7-2),随机引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用随机引物，沿单链模板进行DNA的合成。,末端标记,只将DNA 3端或5端标记的方法称末端标记，常用的方法如下：,(1),DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法(图7-3)。用该酶将含有核素标记的dNTP补平切口或粘性末端。,(2),T4DNA聚合酶标记法。加入dNTP后抑制外切活性可将标记的dNTP进行填充标记。,(3),T4多核苷酸激酶标记法。用该酶可将,-,32,P从,-,32,P ATP转移至核酸的5-OH端,(4),末端脱氧核苷酸转移酶标记法。将多种标记的dNTP逐个转移到核酸缺口中的3-OH端，形成长尾标记。,放射自显影检测杂交信号,利用放射线在X线片的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。这种方法的操作步骤如下：,(1),将滤膜用保鲜膜包好，置于暗盒中。,(2),在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光面向上，压12张X线片，而后再压上增感屏后屏，光面向X线片，盖上暗盒，置于-70，曝光适当的时间。,(3),根据放射线的强度曝光一定的时间后，在暗室里取出X线片，显影定影。如曝光不足，可再压片重新曝光。,第三节 核酸分子杂交技术,在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持物上进行杂交则称为固相杂交。,固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类。固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合，从而获得清晰的杂交图谱，有利于定性或定量分析待测核酸样品中的特定片段(靶序列)，在核酸的结构和功能研究以及基因工程研究中，其应用比液相杂交更为广泛，其技术发展也更为迅速。,一、膜上印迹杂交,膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。,滤膜杂交的基本过程,如图7-8所示。,(1),核酸的制备,(2),电泳,(3),印迹,(4),预杂交,(5),杂交,(6),洗膜,(7),检测,固相支持物的选择,一种良好的固相支持物应具备以下几个特点：,(1),具有较强的结合核酸分子的能力,(2),与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的杂交反应。,(3),与核酸分子的结合稳定牢固，,(4),非特异性吸附少。,(5),具有良好的机械性能。,下面介绍几种常用的固相支持物：,(1),硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等)的非放射性标记探针的杂交体系。,(2),尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适合于一步法的菌落原位印迹法。,尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种蛋白(如BSA、牛奶等)进行预杂交，产生的杂交信号本底较高，与非特异吸附有关。,PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。,印迹方法,虹吸印迹法,(图7-9),利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。,真空转移法,(图7-10),其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，转膜的同时进行DNA的变性和中和，整个过程只需1h左右。,电转法如图7-11所示。,印迹类型,Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图7-12)。,2.,Northern印迹杂交(Northern blot hybridization)：,Northern杂交是将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。其基本原理与Southern杂交相同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等变性方法。,3.斑点杂交(dot hybridization)：直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗(低盐高温)，降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂交。,4.,反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测DNA是否含有这些探针的同源序列。,5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。,二、核酸原位杂交,用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ),一般的原位杂交有两种类型：与胞内DNA的杂交和与RNA的杂交。,三、液相杂交技术,液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针，再进行检测。,