第7章酶学分析技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（一）酶活性的概念,酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量。,即酶反应的速度。,如果在酶反应过程中测得的产物P或底物S的变化量对时间作曲线可得到酶促反应时间进行曲线。,一、酶活性的概念和单位,反应最初阶段，S过量，原始浓度很大。P或S的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内P或S的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为,零级反应期,。,一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。,（二）酶活性单位,酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。,1.惯用单位,60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。,这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位的定义不同，正常参考范围也不同。,缺点：,（1）由惯用单位换等成IU较麻烦。,（2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。,（3）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。,3.Katal单位,为了与法定计量单位（SI）接轨，1972年国际酶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒使1mol底物发生变化的酶量。,1 Kat=6010,6,IU,1 nKat=0.06IU,1 IU=16.67nKat,（三）酶的比活性,是指单位质量的蛋白质所具有某种的活性，用酶活性单位/mg蛋白质来表示，比活性是衡量酶纯度的一个指标，比活性高，表示酶制剂中杂蛋白的含量少，酶纯度高。,酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算公式,二、酶活性单位的计算,如血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L，用量1.0ml，血清0.02ml。,单位定义100ml血清37，作用15min每水解5mg淀粉为一个淀粉酶单位。,如ALT测定速度法 NADH在340nm的摩尔吸光系数为6300,反应液（工作液）1.0ml，血清0.1ml，光径1cm。,三、酶促反应进程,酶促反应不同于一般催化反应，反应不是瞬时完成的，而是经过一个进程。,C,A,B,A 延滞期,B 线性期,C 偏离线性期,反应时间 t,反应速度,酶活性测定原理,酶活性测定不论采用何种方法，都必须符合两个原则。,（1）在零级反应期测定,v,Vmax,常数，即 S或P与反应时间成正比。保持过量底物。,（2）反应速度与酶量成线性关系。,级,反应级数,0级,P,S,反应时间 t,酶促反应时间进程曲线,（一）米曼公式,酶的活性除了受温度pH，抑制剂，激活剂等因素的影响外，还受底物浓度的影响，1913年michacli-memten根据酶作用的中间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为：,四、酶促反应底物动力学,（二）,Km,的意义和应用,1.Km的意义,Km是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。,当,Km可表示酶与底物的亲和力，Km越大，表示E与S的亲和力越小反应，Km越小表示酶与S的亲和力越大。,Km,S,Km是酶的特征性常数之一,，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、pH、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km一般在10,6,10,3,mol/L之间,竞争性 反竞争性 非竞争性,Vm 不变 降低 降低,Km 增大 减小 不变,2.Km的应用,（1）计算不同S时,v,为Vm的百分率,如S10 Km时,（2）确定酶反应中的底物浓度,为了使酶反应的速度接近,Vmax,一般要求S1020 Km，此时,v,9195,Vmax,。,（3）作为鉴别酶的依据,如两种酶对同一底物（相同条件下）表现有相同的Km，则这两种酶为同一种酶，否则为两种不同的酶。,（4）确定酶的天然底物,有些酶可有多种底物，其中Km最小的底物是该酶的最适（天然）底物。,（5）判断酶的激活剂或抑制剂,凡能降低Km的物质为激活剂，凡能增大Km的物质为酶抑制剂。,（6）鉴别酶的抑制类型,根据抑制剂以对Km和Vm的琐影响，可区分抑制类型,。,（三）,Vmax,的意义和应用,Vmax,是指酶完全被底物饱和时的反应速度，在E不变时，对于特定的底物、,Vmax,也是一个常数。,如果已知酶的总浓度，则可从,Vmax,来计算酶的转换率，转换率可代表酶的催化效率，指单位时间内每分子酶所能催化反应的次数。大多数酶的转换率为110,4,s,1,（四）Km和,Vmax,的测定,将S对,v,作用不能求得Km和,Vmax,这是因为,Vmax,是一个渐近的极限值，不可能从实验中直接得到，由于Km是,v,为,Vmax,一半时的S，所以也不能得到Km，一般都将米一曼公式演变成直接方程，然后根据直线方程斜率用标准法求得Km和,Vmax,。,第二节 酶活性测定方法及酶学分析类型,酶学分析是20世纪70年代发展起来的一类检测技术，包括酶活性测定和底物浓度测定两大类型。酶活性的测定方法包括终点法和连续监测法。,根据酶的时间，酶活性测定分为两种类型。,一、酶活性的测定方法,1.终点法,（end-paint amalyin）,测定酶,反应开始后某一段时,间内(从t,1,t,2,)产物或,底物的总变化量称为,终点法。,而t,1,和t,2,是,反应历程中的两个点，,故又称,两点法,。,优点：,简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。,缺点：,无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证结果的真实性。,2.连续监测法（continuoue monitosing）,每隔一定时间（1060s）连续测定酶反应,中产物或底物的变化,量称为连续监测法。,又称,动力法或速率法,，,终点法的测定两个时,间点，该法进行多点,连续测定。,优点：,多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。,缺点：,分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。,三、影响酶活性测定的因素,（一）样品处理的影响,1.溶血,RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。,2.抗凝剂,某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca,2+,的AMS和需Mg,2+,的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。,3.样品存放时间,，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、,G,GT则很稳定。,（二）测定条件的影响,1.温度,温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius公式K=Ae 。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。,（1）温度的选择,37反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25、30可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学较难定在30进行，IFCC建议30作为参考方法的标准温度。,（2）温度系数,将温度每升高10后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数(Q,10,)。,Q,10,表示温度对反应速度影响的大小。,2.pH,（1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。,（2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。,（3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。,（4）使亚基解聚,3.缓冲液性质,酶活性下仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。,（1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph。,如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。,（2）缓冲液对酶活性无抑制作用，,如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。,（3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。,（4）缓冲液在可见光区或紫外区没有成仅有极低光吸收现象。,一、同工酶的概念,1971年国际生化学会（IUB）提出同工酶是指同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体，纯聚体或杂交体，其生物性质不同但能催化相同反应的酶。,同工酶的分布除了具备组织器管特异性外，在同一细胞的不同细胞器中也有不同的分布，这对于提高疾病的诊断有重要意义。,第三节 同工酶测定,（一）电泳法：,常用的电泳材料有醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。,（二）层析法,主要有两种,1.离子交换层析,利用同工酶表面电荷的不同，与离子交换树脂结合，常用的离子交换剂有二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）、二乙氨基乙基葡聚糖A-50（DEAE-SephadexA-50）等。,分离方法,2.亲和层析法,利用多基因位点的同工酶具有不同免疫学特性和不同底物专一性，将特异性配体（如抗体）用固相化技术结合在葡聚糖或琼脂糖凝胶上，样品通过层析柱时，凝胶就能选择性结合某一同工酶，而让其他同工酶通过，然后用洗脱剂洗脱。,评价,可用于同工酶的提纯制备，但费时。,（,三）免疫化学法,利用同工酶的抗原性不同进行分离，主要适用于基因位点的同工酶。,1.免疫抑制法,利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响。,故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推并且该型同工酶的活性，如在CK同工酶中加入足备的CK-MM抗体，则：,CK-MM活性全部被抑制,CK-MB活性抑制50,CK-BB活性不受影响,2.免疫沉淀法,在含有A、B两型同工酶的混合样品中，加入A（或B）的抗体，使A（或B）沉淀，离心后测定上清液中酶活性，可代表B（或A）的酶活性，用加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即得出被沉淀酶活性。,3.免疫测定酶蛋白法,酶是蛋白类抗原，可用各种免疫定量法来测定，火箭电泳法、放射免疫法（RIA）、酶免疫法（EIA），其中后两者灵敏度可达10,9,10,12,g水平。,评价,RIA是目前测定同工酶最可靠、灵敏和特异的方法，但方法较复杂，有放射性污染。,（四）动力学法,1.利用同工酶对底物专一性不同进行分离,如A型醛缩酶（ALD-A）对FDP和F-1-P的活性比值为50，而B型醛缩酶（ALD-B）对FDP和F-1-P的活性比值为1。根据此样品对FDP和F-1-P的活性比值，可大致反映其ALD-A和ALD-B的比例。,2.利用同工酶有不同的最适pH和不同底物的Km进行鉴定,如AST的最适pH为7.4，当pH为6.5时，血浆AST（s-AST）活性明显下降，而线粒体AST（m-AST）仍可保持。另一方面，m-AST对L-ASP的Km为0.7mmol/L，远小于s-AST的Km 5.07mmol/L，因此在pH6.5，L-ASP浓度为5mmol/L，测定的是m-AST活性，而在pH7.4，L-ASP浓度为200mmol/L，测定的是AST活性。,评价,简单快速，不需特殊设备，也不需分离同工酶就可测定，但准确性较差。,（五）热失活法,利用各型同工酶对热稳定性不同而设计的方法。,如ALP同工酶的热稳定性依次为：ALP,4,ALP,2,ALP,5,ALP,3,当血清在60加的热30mim，其它同工酶都以失活，而ALP,4,仅失活5。,评价,最简单易行，不需任何外加试剂特殊仪器，但准确性差，不能准确定量，只能大致估计。,三、同工酶测定的临床意义,同工酶谱的改变能较准确地反映病变的部位和操作程度，对提高疾病的诊断、治疗以及预活分析有重要价值。,二、工具酶,（一）工具酶的概念,作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶,。,G+O,2,+H,2,O 葡萄糖酸+H,2,O,2,H,2,O,2,+4-AAP+酚 红色醌类化合物,CP+ADP C+ATP,ATP+G G-6-P+ADP,G-6-P+NADP,+,6-磷酸葡萄糖酸+NADPH,GOD,POD,CK,HK,G6PD,常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。,（二）工具酶的质量要求,工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。,（三）常用工具酶及其指示反应。,1.NAD(P),或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，最常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH、G6PD，它们都以NAD(P),或NAD(P)H为辅酶。NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。,如 ALT测定 工具酶是LDH,主要缺点：,（1）需要紫外分光光度计,（2）需高纯度的酶和辅酶,（3）灵敏度较低 NADH在340nm，为6300L,mol,1,cm,1,改进方法，在脱氢酶后再偶联一个心肌黄酶，用四氮唑衍生物作为受氢体，生成紫色的甲臢。,NADH,心肌黄酶-FADNAD,心肌黄酶-FADH,2,心肌黄酶-FADH2+INT心肌黄酶+甲唧,INT生成的甲臢最大吸收峰492nm19400,Lmol,1,cm,1,约为NADH在3400m吸光系数的3倍。,2.偶联H,2,O,2,的工具酶及指示反应 GOD、尿酸酶、GlyOD、ChOD等工具酶可分别作用于G、UA、GLy、ch使氧化产生H,2,O,2,，H,2,O,2,在POD的作用下，使无色的色原氧化成有色的色素。,常用的单一色原联苯胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺，3,3,5,5-四甲基联苯胺，有致癌作用，现已不用。,成对色原有,4-氨基安替比林和酚,，是Trinder 1969年提 故称为Trinder反应，是目前最常用的指示反应。,H,2,O,2,+酚+4-AA 红色亚胺醌,其吸收峰为500nm，为13L.mmol,-1,cm,-1,优点：,呈色稳定，线性范围宽，应用广。,缺点：,易受vitC、胆红素、尿酸等还原性物干扰，这些物质能还原H,2,O,2,，使结果偏低。,POD,三、底物浓度测定,1.终点法,将待测底物和工具酶保温一定时间后，待测物全部转变为可直接检测的化合物，从而计算待测物浓度。,如：尿素+H,2,O 2NH,3,+CO,2,产生的NH,3,与尿素的浓度成正比。,由于体液中待测物浓度不高，一般在工具酶Km附近，为了缩短反应时间，实现底物完全转变，可在反应体系中加入“陷阱试剂”使之与反应产物结合，减少逆反应。,脲酶,2.速率法,这种方法不要求将待测物全部转变为可检测的产物，而是利用工具酶的反应速度来测定待测物的浓度。,速率法较终止法简便、省时、干扰少，可测定低浓度物质，需自动分析仪。,血浆、消化液、脑脊液、尿液、羊水中的酶类统称为体液酶。其中血浆酶的测定是临床生化检验的重要组成部分。,一、血浆酶的来源,（一）血浆特异酶,在血浆中发挥特异催化作用的酶称为血浆特异酶，如凝血酶类、纤溶酶类、胆碱脂酶、铜蓝蛋白（CER），LCAT、LPL、肾素等，除LPL来自组织毛细血管内皮细胞，肾素来自肾小球旁器外，其余部分来自肝。,第四节 酶学分析在临床诊断上的应用,（,二）外分泌酶,来源于外分泌腺，如唾液淀粉酶，胰淀粉酶，胰脂肪酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶等。由外分泌腺分泌至消化道，参与食物消化过程，正常血液含量较少。,（三）细胞酶,存在于组织细胞内参与物质代谢的酶，当细胞更新时释放入血液，在血浆中无重要催化作用，主要用于诊断，了解一些组织细胞的结构及功能状态。,二、酶水平的组织专一性,血清中的酶种类很多，但并非所有的酶都能用于诊断，因很多酶可来自机体各组织细胞，无组织专一性，只有少数酶来自一种组织或少数几种组织，它们的活性测定可比较特异地反映相关组织细胞的病理过程，具有临床诊断价值。,高度特异性的有,鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT），山梨醇脱氢酶（SDH），5,-,核苷酸酶（5,-,NT肝、胆），谷氨酸脱氢酶（GLDH），淀粉酶（AMS胰、唾液腺），丙氨酸氨基转移酶（ALT、肝、肾、心），肌酸激酶（CK、骨髓肌、心脑），-谷氨酰转肽酶（-GT或GGT、肝、胆、肾、小肠）。,低度特异性的有,乳酸脱氢酶（LDH、心、肾、骨髓肌、肝、肺）碱性磷酸酶（ALP、小肠、胎盘、肝、肾）。,三、血清酶测定在临床诊断中的应用,（一）在诊断肝胆疾病中的应用：肝脏是物质代谢的中枢，酶类极丰富，当肝细胞损伤时，细胞内酶大量释放入血，或合成的酶减少，导致血精酶含量变化，因此，临床上应用肝组织专一性或相对专一性作为判断肝细胞损伤指标。,反映肝细胞结构与功能的ALT、AST、ADH、ICDH、GLDH、OCT的上升、ChE、LCAT下降。,反映胆道疾病（胆道阻塞）的ALP、GGT、5,-NT上升。,判断肝纤维化程度的 MAO上升,（二）在诊断心肌梗死中的应用,主要有AST、LDH，CK-MB，AST分布较广，但心肌含量最多（156000u/g湿组织）LDH属低特异酶类组LDH,1,在心肌中含量高（占LDH总活性3570），正常血清LDH,2,LDH,1,，心肌梗死，CK-MB在血清活性可增高1025倍，阴性率10，CK-MB是诊断心肌梗死的最佳指标。,（三）在诊断胰腺疾病中运用,主要有AMS，脂肪酶均来自胰腺泡分泌，急性胰腺炎、血清AMS，2-12h开始上升，1272h达高峰，4d左右恢复正常，尿AMS阳性率高于血清，特续时间长，脂肪酶在胰腺炎与淀粉酶平行，但其他急腹症时该酶活性不升高，故特异性较高，但尿中检测不具脂肪酶。,（四）在诊断骨骼与骨骼肌疾病中的应用,主要是ALP，各种骨疾病中血清ALP均上升，特别是成骨肉瘤及畸形骨炎，增至正常45倍与30倍，恶性肿瘤骨转移，骨质软化症，佝偻病等ALP均上升。,骨骼肌疾病CK、ALD（醛缩酶）、AST、LDH.,（五）在诊断前列腺疾病中的应用,主要是ACP，成年男性，血清ACP有1/31/2来自前列腺，特别是前列腺Ca的诊断。,