食品化学酶.ppt

*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第一节 引论,一、酶对食品科学的重要性,控制着所有重要的生物大分子的合成、分解,食品加工的主要原料是生物材料,生物材料中含有大量的酶,酶的作用,有益的：皱胃酶、蛋白酶,有害的：果胶酶、脂酶,有效地使用和控制内源酶和外源酶,二、酶的本质,定义（1979年）,酶是具有,催化性质,的,蛋白质,，其催化性质源自于它特有的激活能力。,目前,并非都是蛋白质,酶是生物催化剂,不参与反应，反应结束时保持不变,酶在物理和化学状态上的改变是可逆的,酶反应中包含可逆的中间络合物,酶被反复使用,酶的周转率（Turnover）,在酶被完全饱和条件下，单位时间内底物被每个酶分子转变成产物的分子数。,大多数酶，110,4,s,-1,少量的酶（昂贵）大量的生物转化,三、酶的命名,习惯命名,-淀粉酶、纤维素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化物酶或过氧化氢酶,商品名称,系统命名,4位数字组成的酶委员会编号（EC number）,酶的系统命名的原则,例：聚半乳糖醛酸酶，EC 3.2.1.15,水解酶，糖苷键，O-糖苷,四、酶的辅助因子,酶在作用时需要有一个非蛋白质组分存在，这个组分称为辅助因子,分类,金属离子,羧肽酶-Zn，激酶-Mg,有机化合物B族维生素,辅酶（coenzyme）,五、在生物体中的酶,酶在原料的生长和成熟中起重要的作用,原料收获后酶仍然起作用,直至酶的底物被耗尽或酶变性,由于细胞结构的解体常使酶活力提高,果胶酶使番茄组织软化,多酚氧化酶使果蔬褐变,（一）酶的分布,不均匀的，定位化，区域化分布,一种酶往往仅存在于细胞的一类细胞器，专门执行有限种类的酶催化反应,细胞核：核酸的生物合成和水解降解,线粒体：与ATP有关的氧化还原酶,溶菌体和胰酶原颗粒：水解酶,特定的器官含有特定种类的酶,胃肠道、口腔、小肠,植物的种子：水解酶,（二）酶的隔离分布和与底物的接近,在完整的细胞内，酶通过各种方式和底物隔离,细胞器、细胞膜、细胞壁、内源酶抑制剂,组织解体使酶与底物接近,会导致食品的色泽、质构、风味、芳香和营养质量上的改变,热处理、低温保藏和酶抑制剂的使用有助于稳定产品质量,（三）酶在食品原料中的含量,不同食品原料所含酶的种类和数量不同,同一种酶在同一种食品原料中的含量还取决于,生物体的年龄（成熟度）,生长的环境条件,温度、水的供给、土壤、肥料,六、酶的纯化和测定,不是纯酶，含有杂酶和非酶组分,酶的分离纯化技术包括：,选择性沉淀,高浓度盐或有机溶剂,膜分离技术,柱层析技术,凝胶过滤色谱分子大小,离子交换色谱电荷密度,亲和色谱特定基团的亲和力,选择生产酶制剂的微生物,产生的酶纯度高，价格低廉,常使用霉菌和细菌酶制剂,酶回收再利用，降低成本,酶的固定化技术,酶活的测定,测定酶活力的方法,通过定量测定酶反应的产物或底物的变化进行测定,通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如粘度来测定,酶活定义,在一定条件下，催化单位底物转变成产物所需的酶量。,酶活单位,U:,国际生物化学协会酶委员会定义:每分钟催化1,mol底物发生转变的酶量即：,1,mol/min,。,kat：,酶活力的SI单位，即Katal。,Katal的定义是每秒钟催化1mol底物发生转变的酶量，即：,1mol/s,。,换算关系,1 kat=610,7,U 1 U=1.66710,-8,kat=16.67 nkat,第二节 影响酶活力的因素,内在因素,酶的浓度,底物的浓度,环境条件,pH,温度,水分活度,抑制剂,一、底物浓度,反应速度V和底物浓度S的关系非线性,酶“饱和”,酶反应,E+S ES E+P,E 游离状态酶,S 底物,ES 酶-底物络合物,P 反应产物,k 反应速度常数,k,1,k,-1,k,2,Km：Michaelis 常数，米氏常数,Vmax：最大反应速度，所有的酶都以ES形式存在，及酶被底物饱和,截距=1/v,max,斜率=Km/v,max,1/v,v,max,的意义,在最适条件和被底物饱和时的理论上的最高酶活力,Km的意义,v=v,max,/2时，Km=S,当酶反应速度达到最高反应速度一半时的底物浓度,Km指示酶与底物的亲和力,较低Km，亲和力高，催化效率高,二、酶浓度,当ES，,反应速度酶浓度,长时间范围内,初速度保持不变，然后下降,初速度保持的时间与酶的种类有关,酶活下降的原因,产物的抑制作用,酶失活,反应动力学,反应早期,S是一个常数,酶反应是零级反应,反应进行,S下降,反应遵循一级动力学,反应速度常数,三、pH,S形或钟形,pH影响酶活力的原因,pH影响酶分子上电荷的分布,取决于酶蛋白质的氨基酸侧链上可离解基团的状态,可离解基团可能处于酶的活性部位，因此影响酶与底物的结合和催化作用,V-pH曲线确定最适pH,采用酶反应的初速度,酶的pH 稳定范围,测定方法,相同的温度、缓冲液、酶浓度,不同的pH下保温,极端的pH一般会使酶失活,大多数酶的最适pH在4.5-8.0,特殊情况,胃蛋白酶-1.8,精氨酸酶-10.0,四、温度,（,一）酶的热稳定性,测定方法：酶液置于不同温度下保温一定时间后测定酶活,酶失活动力学,遵循一级动力学 ln u-lnu,0,=kt,Arrnenius方程,Ea：酶热变性的活化能,R：通用气体常数,ln残余百分酶活时间 呈线性关系,直线的斜率为,（二）酶催化反应的活化能,高活化能表示反应速度随温度的提高很快提高,酶降低活化能，产生两个效果,低温下，使高比例的反应物转变成产物,升高温度对酶反应速度造成的影响相对较小,在酶稳定的范围内，尽可能采用高温,（三）低温下酶的活力,加热使有损质量的内源酶失活,食品原料部分冻结（0以下）时，酶的活动并没有完全停止,低温使酶活力下降,但应避免稍低于冰点的温度保藏食品,水冻结后，酶和底物浓缩，促进酶活,冻结和解冻破坏组织结构，酶容易接近底物,五、水分活度,食品原料中的水分含量必须低于1%2%，才能抑制酶活力,有机溶剂（甘油）和水混合,水分体积分数减少，酶活力下降,有机溶剂对酶反应的影响,影响酶的稳定性和反应进行的方向,有机溶剂与水不互溶,反应移向催化合成反应,有机溶剂与水互溶,反应移向催化水解反应,六、酶抑制动力学,G的绝对值很小，逆向反应不能忽视,产物的积累产生抑制作用,其它物质也会产生抑制作用,对酶的抑制可以是不可逆的,但可逆抑制更常见,动力学方程式,（一）竞争性抑制,ES不和抑制剂结合，EI不和底物结合,竞争性抑制剂的结构和底物相似，这两种分子与酶结合的部位相同,S+E 与 I+E竞争,v,max,没有影响，Km,底物S足够高，可以消除竞争性抑制,（二）非竞争性抑制,S+E 不影响 E+I,Km没有影响，v,max,I同时和S、E反应,增加S不能消除,（三）反竞争性抑制,I不与E反应,Km、v,max,都同步减小,很少见,七、其他环境条件,（一）粘度,90%以上的自由水被冻结,未冻结相的粘度会显著提高,酶和底物分子的移动性降低,酶活力下降,（二）压力,一般压力不致于高到使酶失活,几种处理方式相结合时，导致酶失活,压力-高温处理,压力-高剪切处理,高压灭酶,（三）剪切,混合、管道输送、挤压，使酶失活,在作用停止后，酶活再生,（四）超声能量,使酶失活,空化作用（起泡）导致酶的界面变性,酶失活过程不符合一级动力学,（五）离子辐射,离子辐射能使酶完全失活所需的剂量比破坏微生物所需的剂量大10倍。,缺氧和干燥条件下，酶稳定性高,室温下比低温下失活的程度高,采用热-离子辐射结合处理的方法,（六）溶剂,与水不互溶的溶剂稳定酶,互溶的溶剂能使酶失活,温度低时，较稳定,第三节 固定化酶,酶被固定成为不溶解的状态,优点,酶的稳定性提高,酶能反复多次使用,产物中不含酶，不需要采用热处理灭酶，有助于提高食品的质量,一、酶的固定方法,（一）吸附,将酶吸附在氧化铝、有机聚合物、玻璃、无机盐或硅胶等材料上,优点：,无需特殊化学试剂，简便价廉,缺点：,结合力是弱键作用，当温度、pH和离子强度改变，或者当底物存在时，结合的酶可能会解吸。,（二）共价连接,化学试剂或双官能试剂（如戊二醛）,载体,优点：,共价键牢固，酶不易泄漏,缺点：,一部分酶起着载体的作用而失去了催化能力，因此用交联法固定的酶活力较低。对于价格昂贵的酶，不经济。,（三）载体截留,凝胶（聚丙烯酰胺）,特点：,低MW底物可通过扩散自由进入凝胶颗粒，酶和高MW的终产物不能从凝胶颗粒中渗漏出去。,局限：,只能适用于低MW底物。食品体系常常有大分子。,酶通过扩散而损失的可能性还是存在的。,（四）胶囊包合,类似载体截留法，形成很小的颗粒或胶囊,硝酸纤维素或尼龙,只适合低MW底物,二、固定化酶动力学,酶被固定，仅底物能自由扩散,酶的载体被扩散层包围,邻近酶的底物浓度低于体相中底物浓度,静电作用,反应初速度v,0,不再适用,表观米氏常数,扩散项,静电项,X、D：扩散系数 较小的载体或提高流动速度可使X，Km*,Z、v：与电性质有关 底物和载体电荷相同，Km*,酶-底物亲和力,三、固定化酶在食品工业中的应用,仅有少数固定化酶被应用于工业化,固定化葡萄糖异构酶，生产高果糖浆,玉米淀粉 糊精（DP10）,葡萄糖 高果糖浆,-淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,葡萄糖异构酶,菌种,链霉素、凝结芽孢杆菌、放线菌,载体,DEAE-纤维素、多孔陶瓷,反应平衡常数=1，葡萄糖=果糖,其它固定化酶,氨基酰基转移酶,天冬酶,富马酸酶,半乳糖苷酶：水解棉子糖,（防止蔗糖结晶）,乳糖酶：水解乳糖,（乳糖不耐症）,应用于食品分析,酶电极,第四节 内源酶对品质的影响,酶对生物体的重要性,酶催化反应产生的效果,加快食品变质的速度,提高食品的质量,控制酶活力,一、颜色,颜色食品质量,以瘦肉为例,氧合肌红蛋白红色,脱氧肌红蛋白紫色,高铁血红蛋白(Fe,2+,氧化为Fe,3+,)褐色,导致色素变色的三种酶,1.,脂肪氧合酶,六方面的功能,小麦粉和大豆粉的漂白,面团制作中形成二硫键,破坏叶绿素和胡萝卜素,产生氧化性的不良风味,氧化破坏维生素和蛋白质,氧化破坏必需脂肪酸,有益,有害,脂肪氧合酶催化过程,作用于不饱和脂肪酸产生自由基中间物,产生氢过氧化物,进一步非酶反应，产生醛等不良风味,最敏感的氨基酸是半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸,2.叶绿素酶,水解叶绿素产生植醇和脱植基叶绿素,果蔬失去Mg,2+,，失去绿色,3.多酚氧化酶,存在于植物、动物和一些微生物中,催化两类反应,羟基化,氧化,黑色素褐变,非酶反应,控制多酚氧化酶的活力,消除氧和酚类化合物,抗坏血酸、亚硫酸盐和巯基化合物,有还原性，将邻-苯醌还原成底物，防止黑色素,直接使酶失活,破坏活性中心的组氨酸残基和Cu,2+,非底物的酚类（苯二酚、苯甲酸）,酶抑制剂（与底物竞争酶）,二、质构,果蔬,果蔬的质构取决于碳水化合物,果胶物质、纤维素、半纤维素、淀粉、木质素,自然界存在作用于碳水化合物的酶,动物组织和高蛋白质植物组织,蛋白酶作用导致质构的软化,（一）果胶酶,1.果胶甲酯酶,水解甲酯键，生成果胶酸和甲醇,二价离子Ca,2+,存在时，与羧基交联，提高质构强度,2.聚半乳糖醛酸酶,水解,-1,4 糖苷键,包括两种,内切：从果胶分子内部水解糖苷键,端切：水解分子末端的糖苷键,3.果胶酸裂解酶,存在于微生物中，非高等植物中,裂解果胶和果胶酸分子中的糖苷键,形成一个含还原基团的产物和一个双键产物,235 nm 处有特征吸收,（二）纤维素酶,果蔬中的纤维素影响细胞的结构,纤维素酶与食品原料的软化有关,微生物纤维素酶将不溶性纤维素转化为葡萄糖,（三）戊聚糖酶,存在与微生物和一些高等植物中,水解木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖（5碳聚糖）,小麦中存在,微生物戊聚糖酶制剂,（四）淀粉酶,存在于动物、高等植物和微生物中,淀粉决定食品的粘度和质构,淀粉降解,淀粉酶的类型,-淀粉酶,存在于所有的生物,内切酶，水解“干”,显著影响粘度,高温下才失活,-淀粉酶,存在于高等植物中,端解酶，水解“支”,被巯基试剂（半胱氨酸）所抑制,葡萄糖淀粉酶,（五）蛋白酶,蛋白质决定动物性食品原料的质构,1组织蛋白酶（Cathepsins）,存在于动物组织细胞的溶菌体内,五种组织蛋白酶：A、B、C、D和E，还分离出一种组织羧肽酶,参与了肉成熟期间的变化,宰后pH下降，酶释放，导致肌原纤维以及胞外结缔组织（胶原）分解,在酸性pH具有活性。在pH 2.54.5范围内具有最高的活力。,2钙离子激活中性蛋白酶,两种：CANP和CANP,都是二聚体,含有相同的较小亚基（MW=30,000）和较大的亚基（MW=80,000，免疫性质不同）。,活性部位中含有半胱氨酸残基的巯基，被归属于半胱氨酸（巯基）蛋白酶,CANPS的作用,CANP I 完全激活：,50-100,mol/L Ca,2+,CANP II 的激活：,1-2,mmol/L Ca,2+,肌肉中的活力是很低的,通过分裂特定的肌原纤维蛋白质影响肉的嫩化,同溶菌体蛋白酶协同作用,死后僵直的肌肉缓慢松弛，这样产生的肉具有良好的质构,3乳蛋白酶,碱性丝氨酸蛋白酶,水解-酪蛋白产生疏水性更强的-酪蛋白，也能水解,s,-酪蛋白，但不能水解-酪蛋白,奶酪成熟过程中参与蛋白质的水解作用,对热较稳定，形成乳的凝胶,还存在着一种最适pH 4左右的酸性蛋白酶，易热失活,三、风味,1,硫代葡萄糖苷酶,在芥菜子和辣根中存在着芥子苷,S-糖苷发生糖苷配基裂解和分子重排,产物中异硫氰酸酯是含硫的挥发性化合物，与葱的风味有关,芥子油即为异硫氰酸烯丙酯,裂解和分子重排,芥子油,具有特殊风味,S-糖苷的酶分解,2.过氧化物酶,普遍地存在于植物和动物组织中,过氧化物酶活力会损害食品的质量，未经热烫的冷冻蔬菜所具有的不良风味与酶的活力有关,各种不同来源的过氧化物酶通常含有一个血色素（铁卟琳）作为辅基。,过氧化物酶催化下列反应：,ROOH+AH,2,H,2,O+ROH+A,ROOH：有机过氧化物,AH,2,被氧化，是电子给予体,抗坏血酸、酚，胺或其他有机化合物,被氧化成有色化合物,分光光度法测定过氧化物酶的活力,电子给予体,过氧化物酶的热稳定性,热失活具有双相特征,每一相都遵循一级动力学,热失活曲线的3部分,热不稳定部分,过渡区域,热稳定部分,过氧化物酶的再生,非常耐热，作为果蔬热处理是否充分的指标,其它作用,作为过氧化氢的去除剂,参与木质素的生物合成,参与乙烯的生物合成,作为成熟的促进剂，与果蔬的成熟有关,四、营养质量,脂肪氧合酶,必需脂肪酸含量的下降,氧化过程中产生的自由基，降低维生素和氨基酸含量,抗坏血酸氧化酶,硫胺素酶,破坏硫胺素（氨基酸代谢中必需的辅助因子）,核黄素水解酶,多酚氧化酶,引起褐变的同时，降低有效赖氨酸的含量,第五节 作为食品加工的助剂 和配料而使用的酶,使用酶的目的,回收副产物,制造食品,提高提取的速度及产量,改进风味和稳定食品质量,使用酶的优点,天然、无毒,催化的特异性，不造成不需要的副反应,一般是粗酶制剂，可能会产生不期望的产物；但使用高纯度的酶制剂在经济上不合算,在很温和的温度和pH条件下具有活性,低浓度时有活性,易于控制反应速度,在反应进行到期望的程度后即可使酶失活,酶的来源,可食的和无毒的植物、动物以及非致病、非产毒的微生物,微生物来源酶的优点,生产能力强,诱变或改性,胞外酶，易于回收,生产原料易于获得,一、甜味剂中使用的酶,酶法生产甜味剂,二、脂酶,水解处在油/水界面的三酰基甘油的酯键,广泛地分布于植物、动物和微生物,动物胰脏脂酶和微生物脂酶是脂酶的主要来源,水解方式,1,2-二酰基甘油,三酰基甘油 一酰基甘油,2,3-二酰基甘油,脂酶的专一性,酰基甘油专一性,优先水解低MW的三酰基甘油底物,位置专一性,如胰脂酶，仅水解1,3位置的酯键,能水解1位和2位酯键的脂酶可能是混合酶,脂肪酸专一性,水解特定脂肪酸形成的酯键,微生物白地霉脂酶油酸，优先水解,立体定向专一性,脂酶的应用,奶酪加工中,从乳脂中释出风味前体和风味化合物,三酰基甘油改性,通过脂酶催化的酯交换反应，生产新的甘油三酯，后者具有期望的熔点或其他性质,在非水环境下有可能实现，如果有水存在，脂酶将快速水解甘油三酯,技术关键：固定化脂酶制剂,油脂水解,技术上可行，能否应用于实际生产取决于它和其他技术，例如蒸汽裂解的竞争,从天然的甘油三酯制备多不饱和脂肪酸时，会优先考虑酶法,合成乳化剂和风味剂,安全、天然,三、蛋白酶,蛋白酶的来源,内源蛋白酶,肉类成熟,酵母自溶制备酵母提取物,微生物分泌的蛋白酶,加入的蛋白酶制剂,蛋白质强化饮料,蛋白酶的作用,改进食品蛋自质的性质,MW分布发生变化,水解度，MW小的肽的比例,水解蛋白质的溶解度,乳化能力和起泡能力改变,控制蛋白质的水解程度是至关重要的,蛋白质的酶水解过程,肽键水解后，羧基和,-,氨基间产生质子交换,在,pH 6.5,以上时，质子化的氨基酸将离解,要保持反应体系,pH,不变，就必须加入碱液,采用pH-stat法控制水解度（DH）,适用于中性或碱性蛋白酶,B 碱消耗的当量数,-氨基的平均离解常数,h,总,可被水解的肽键数，8,蛋白酶的分类,按活性中心所含有的必需的催化基团分类,丝氨酸蛋白酶,-,羟基,胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶以及微生物蛋白酶,巯基蛋白酶（或半胱氨酸蛋白酶）,-,巯基,木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以及微生物蛋白酶（链球菌蛋白酶）,金属蛋白酶,-,Zn,2+,肽链端解酶，例如羧肽酶A,天冬氨酸蛋白酶（或酸性蛋白酶）,-,羧基,最适pH范围是,2-,4,蛋白酶的应用,制备水解蛋白质（如生产大豆水解蛋白）,从油料种子加工分离蛋白质,制备浓缩鱼蛋白质,改进明胶生产工艺,凝乳酶和其他蛋白酶应用于干酪生产,从加工肉制品的下脚料回收蛋白质,对猪（牛）血蛋白质进行酶法改性脱色,作为食品添加剂改善食品的质量,木瓜蛋白酶用于配制肉类嫩化剂,减少 啤酒低温混浊现象,四、果胶酶,1,提高果汁得率,果实破碎后加入果胶酶，降低粘度，再压榨或离心,2果汁澄清,直接压榨后，用果胶酶处理，使果汁混浊的粒子沉淀下来,混浊粒子是蛋白质-碳水化合物复合物，粒子表面带负电荷，在果胶等构成的保护层里面则是带正电的蛋白质,苹果汁澄清包括酶催化果胶解聚和非酶静电相互作用两个阶段。,五、纤维素酶,使纤维素增溶和糖化,分为4类,内切葡聚糖酶,粘度快速下降，还原基团缓慢增加,纤维二糖水解酶,端解酶，还原基团较快增加,端解葡萄糖水解酶,水解速度随底物链长的减小而降低,-葡萄糖苷酶,水解速度随底物链长的减小而增加,第六节 酶在食品分析中的应用,优点,酶具有高度灵敏度和专一性，无需将待测物与试样中其他组分分离,步骤简单，节省时间,可以将非酶造成的化合物的变化降至最低,缺点,试剂昂贵，尤其是纯酶,一、被测定的化合物是酶的底物,1,标准曲线法,适用条件,待测物的浓度必须小于100Km（最好小于5Km）,计算方法,根据米氏方程,关键,严格控制酶反应的条件，制作关系良好的标准曲线,2总变化法,适用条件,反应必须进行完全,方法,从反应前后酶反应体系的吸光度或荧光的总变化测定产物（或底物）的量,优点,不需要精确控制酶反应条件,缺点,需要使用较多的酶,二、待测物是酶的激活剂或抑制剂,激活剂反应初速度增加时，可根据增加的程度测定该化合物的浓度。,三、固定化酶在食品分析中的应用,重复使用，降低每次分析的费用,使分析工作更加快速和简易,使用形式,固定化酶柱、酶电极、含酶薄片和结合酶的免疫吸附剂（ELISA）,四、酶作为食品质量的指示剂,指示热处理是否充分,检测食品原料是否经受冷冻和解冻,检测食品受细菌等污染的程度,指示水果的成熟度,可能出现过分褐变的指示剂,洋葱和大蒜风味,体外酶法评价高蛋白食品的营养质量,