植物组织培养技术第一章第二章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物组织培养技术第一章第二章,在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,一、,实验室设计原则：,1、保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,2、培养室减少通风,3、具有缓冲室,二、实验室组成及其功能：,（一）组成：化学实验室、洗涤室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室和温室或大棚。,（二）各实验室的设置及功能,1、化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。,主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。,2、洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。,主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。,灭菌设备：,高压蒸气灭菌锅,用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。,工作原理：,在密闭的蒸锅内，01MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,使用方法：,首先检查灭菌锅内是否有水，而且水刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.1-0.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打开入入气阀，取出灭菌材料。,注意事项：,对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。因此，调PH值时，可适当调高0.10.3个单位。,接通电源前一定要加入足量的水。,3、无菌操作室（接种室）,：,主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。,主要设备：紫外光源、,超净工作台,、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。,接种室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。,接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。,接种室应设有缓冲间，面积1m,2,为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。,接种设备：,无菌超净工作台,用于培养材料的消毒及接种。,使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。,电炉,推车,酒精灯,封口膜,接种器具,灭菌器,培养瓶,4、培养室,：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。,培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。,培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。,室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。,主要设备：,培养架（控温控光控湿）、,摇床、培养箱、紫外光源等。,培养设备,带日光灯的,培养架,，主要用于接种后材料的培养。,恒温箱,：,又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。,摇床与转床,：,在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及转速。,5、细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。,主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。,其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。,显微镜包括解剖镜，倒置显微镜，生物显微镜等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。,分注器,血球计数器,移液器,磁力搅拌器,低速台式离心机,4.驯化设备,温室,防虫网室,5、其它辅助设备,培养基灌装机及洗瓶机,除湿机,：使培养室的湿度保持在定的范围内。,空调机,：,用于接种室和培养室温度的控制。,烘箱,：,用于干燥洗净后的玻璃器皿，还可用80的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。,冰箱,：,用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。,纯水机与蒸馏水发生器：,天平,：,天平包括分析天平，电子天平，药物天平等，用于制备母液时培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类物质，天平的精确度要到0.0001g，这就要求精确度更高的分析天平。,酸度计,：用于校正培养基和酶制剂的PH。,第二节 培养基,一、培养基(culture medium),的定义,培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，,首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。,以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。,二、培养基的种类,培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：,1、MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。,2、B,5,培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B,5,培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,3、White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO,4,的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。,4、N,6,培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO,3,和（NH,4,),2,SO,4,含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,5、KM8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,三、培养基的成分,培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。,（一）水,是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,（二）无机元素(inorganic element),1、大量元素,，指浓度大于0.5mmolL的元素等。其作用是：,(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO,3,N和NH,4,N两种形式供应。大多数培养基既含有NO,3,N又含NH,4,N。NH,4,N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO,3,、NH,4,NO,3,等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。,(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH,2,P0,4,或NaH,2,P0,4,等。,(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为13mgL为好。制备培养基时，常以KCl、KN0,3,等盐类提供。,(4)Mg、S和Ca,Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；,S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO,4,7H,2,0提供。用量为13mg/L较为适宜；,Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl,2,2H,2,O提供。,2、微量元素,指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用FeSO,4,，和FeCl,3,(因其在pH值5.2以上，易形成Fe(OH),3,的不溶性沉淀)，而用FeSO,4,7H,2,0和Na,2,EDTA结合成合物使用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,缺锰症状：先是叶脉间缺绿，然后出现坏死斑点。症状先出现在新叶上。,缺锌症状：叶脉间缺绿，玉米出现花叶病，果树易得小叶病，生长素合成受阻，老叶先出现症状。,缺铜的症状：叶尖变白坏死，然后沿叶脉向叶基部发展，叶片易脱落。铜在体内不易移动，缺铜症状首先表现在老叶上。,（三）有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为,基本培养基（basic medium)。,为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,1、碳水化合物,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。,不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,2、维生素(vitamin),这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。,主要有V,Bl,(盐酸硫胺素)、VB,6,(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB,12,等。一般用量为0.11.0mgL。有时用量较高。VB,1,对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB,6,能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,3、肌醇 (myoinosltol),又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。,肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸（肌醇六磷酸脂），植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,（四）天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,1、,椰乳,是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nm时，椰乳就不发生作用。,2、,香蕉,用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。,3、,马铃薯(potato),去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。,4、,水解酪蛋白,为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。,5、,其他,酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；,麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,（五）植物生长调节物(hormone),植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,1、生长素类(auxin),在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10,-5,-10,-8,mgL)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。,（1）IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,（2）NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,（3）IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。,（4）2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,2、细胞分裂素类(cytokinin),这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin 激动素)、Zt(zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：,诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。,促进细胞分裂与扩大。,抑制根的分化。,因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,高 有利于根的形成和愈伤组织的形成,生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化,低 有利于芽的形成,生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.05-10mgL。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose(0%,),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots,and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant.No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface,and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant,along with roots from the lower surface.The result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No BAP,BAP reduced to 0.1 mg.l,-1,No NAA,Poor shoot development and no roots.Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg.l,-1,More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg.l,-1,Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,and few shoots.Some callus,No MS salts,No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g.l,-1,Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g.l,-1,Shoots developed on upper surface of explant.No roots or callus,.,（六）培养材料的支持物,1、琼脂(agar),在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。,琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。,2、抗生物质(antibiotic),抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。,添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。,3、活性炭(active carbon),活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5-l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛及激素等。,活性炭的应用,茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阈值，一般为0.1%-0.2%，不能超过0.2%。,活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。,此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。,活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。,但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放入培养基，会带来不良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,其他,有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,二、配制培养基的准备工作,1、配制母液,大量元素母液（N、P、S、K、Ca、Na、Mg等大量元素的无机盐混合液）,微量元素母液（Mn、Mo、Co、Cu、Zn、B、I等微量元素的无机盐混合液）,铁盐母液（一般使用螯合铁Fe-EDTA),有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）,植物激素母液（各种植物激素单独配制的母液）,2、配制母液的注意事项：,（1）配制无机盐母液要防止混合各种盐时 产生沉淀，各种药品必须在溶解后才能混合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根、磷酸根错开，以免相互结合生成沉淀。,另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，混合要慢，注意搅拌。,（2）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加顺序，以防止沉淀的产生。铁盐由于易和其他混合液产生沉淀。,（3）有些生长调节物质不溶于水，2，4-D、NAA、IAA、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。,3、配制好的母液贴上标签,注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时应移取的量。,注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。,三、培养基的制备方法,1.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。,2.按需吸取母液、蔗糖和琼脂,3.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。,4.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。,5.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。,6.分装与灭菌,第三节外植体的选择与处理,一、外植体的类型,(一）外植体的类型,1.带芽的外植体,2.由分生组织构成的外植体,（二）选择外植体应注意的问题,1、确定取材部位,2、器官的生理状态和发育年龄,3、取材的季节,4、离体材料的大小,5、取得离体材料的植株质量,二、外植体的消毒,（一）常见的消毒剂,最常用的是次氯酸钠、次氯酸钙和升汞。,（二）常用的消毒方法,1.茎切段和叶片的消毒,2.果实及种子的消毒,3.根及地下储藏器官的消毒,4.花药的消毒,第四节无菌技术,一、试验材料和器具的消毒与灭菌技术,1.物理方法,（1）,湿热灭菌（培养基）,培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到01MPa时压力0.1-0.15MPa，20min。,灼烧灭菌,（,用于无菌操作的器械,）,在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。,干热灭菌（,玻璃器皿及耐热用具）,干热灭菌是利用烘箱加热到160-180 的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。,过滤灭菌（不耐热的物质,）,一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。,防细菌滤膜的网孔的直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。,紫外线和熏蒸灭菌（空间）,(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。,(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。,常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按58mlm3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。,化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。,喷雾灭菌（物体表面）,物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%1%的新洁尔灭也可以。,2.化学方法,灭菌剂,使用浓度(%),持续时间（min）,去除的难易,效果,次氯酸钙,910,530,易,很好,次氯酸钠,2,530,易,很好,氯化汞,0.11,58,较难,最好,抗菌素,450mg/L,3060,中,较好,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,二、无菌操作要求,三、无菌室空气污染情况的检验,1.平板检验法,2.斜面检验法,3.空气污染情况检验,四、无菌操作技术,1.实验器具和材料的准备,2.用70%的酒精擦拭超净工作台，开净化工作台和室内紫外灯。,3.关紫外灯、打开风机，过510分钟进入缓冲间。,4.用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具。,5.进行外植体的分离与接种,6.完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手,第五节植物组织培养环境条件的控制,一、温度,一般为2327。喜温性植物如茄科、禾本科、兰科等2628，冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等1822.,二、光照,1.光照强度 一般为20003000lx,2.光质：一般在419467nm,3.光周期:16h的光照，8h的黑暗。,三、湿度,一是 培养器皿内的湿度条件,二是培养环境的湿度条件50%80%,四、气体,氧气,作业,1.简述植物培养实验室设计原则,2.配制母液时应注意什么？,3.植物生长物质为什么要单独配制母液？,第二章植物细胞全能性及其营养代谢第三章培养物的脱分化与再分化,第一节外植体的脱分化,一、诱导期间的细胞脱分化过程,1、启动阶段：细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现。,2、演变阶段：细胞核开始向中央移动，质体演变成原生质体。,3、脱分化：细胞恢复到分生细胞阶段，细胞分裂即将开始。,二、与脱分化有关的因子及其作用,1、损伤刺激,2、培养细胞的异质性,3、生长物质的影响,4、光线的影响,第二节愈伤组织的形成与调控,一、愈伤组织形成的过程,1、诱导期,2、分裂期,3、形成期,二、愈伤组织的生长和调控,1、有旺盛的自我增殖能力,2、容易散碎,3、具有高度的胚性或再分化能力,4、经过长期继代保存而不丧失胚性。,第三节 培养物的分化,一、细胞分化和组织分化,1、细胞分化：指导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。,2、组织分化：指离体培养物在细胞分化的基础上，可进一步分化出各种各样的组织。,二、器官分化和植株形成,1、器官分化,2、植株形成,思考题,愈伤组织的形成经过哪几个时期？,第四章 植物组织器官培养,第一节茎尖培养,一、茎尖培养的意义,1、用于无性系快速繁殖,2、用于脱除植物病毒,3、用于育种,4、用于形态建成研究,二、茎尖培养方法,1、建立无菌材料,2、茎尖的发育方向及其调节,（1）腋芽萌发,（2）脱分化后产生胚状体,（3）脱分化后直接产生不定器官,（4）脱分化后形成愈伤组织,3、生根成苗及移栽,第二节其他器官和组织培养,一胚的培养,1、用于胚的挽救,2、打破种子休眠,3、克服柑橘、芒果等植物珠心胚的干扰，获得杂种胚。,4、诱导胚状体及胚性愈伤组织的产生,5、用于种子生活力的快速测定。,二、离体根的培养,1、根无性系的建立,2、离体根培养的试验系统,三、离体叶的培养,四、花的培养,五、幼果的培养,六、愈伤组织的培养,1、愈伤组织的诱导,（1）材料的消毒与接种,（2）愈伤组织的培养,2、愈伤组织的继代,