志贺氏菌的检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,志贺氏菌的检验,一、志贺氏菌的生物学特性,志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。,志贺氏菌和大肠杆菌都属于肠杆菌科，根据DNA杂交研究结果表明，志贺氏菌属的四个种和大肠杆菌属在生化上是难以区分的，因为有产气的志贺氏菌，也有乳糖阴性、不产气、不运动的大肠杆菌，有些大肠杆菌也能引起痢疾状的腹泻。,肠杆菌科中常见各属细菌,肠杆菌科共同特性，都是革兰氏阴性小杆菌，好氧或兼性厌氧，没有芽孢。,属 代表种 致病性,埃希氏菌属 大肠埃希氏菌 肠道外感染，急性腹泻,志贺氏菌属 痢疾志贺氏菌 细菌性痢疾,爱德华氏菌属 迟纯爱德华氏菌 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌,偶见于健康人或腹泻者粪便内,沙门氏菌属 伤寒沙门氏菌 肠热症、急性肠炎、败血症,枸橼酸杆菌属 弗劳地氏枸橼酸杆菌 条件致病菌，引起继发性感染,克雷伯氏菌属 肺炎克雷伯氏菌 肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等,肠杆菌属 产气杆菌 很少引起原发性感染,哈夫尼亚菌属 蜂窝啥夫尼亚菌 对人无致病性,沙雷氏菌属 粘质沙雷氏菌 件致病菌，引起泌尿系,呼吸道及创伤感染,变形杆菌属 通变形杆菌 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等,耶尔森氏菌属 鼠疫耶尔森氏菌 鼠疫,欧文氏菌属 草原居民欧文氏菌 植物寄生菌,从人体肠道及化脓扁桃体中分离到,1、志贺氏菌的形态学特征：,志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为,革兰氏阴性杆菌,，,长约2-3 m,宽0.5-0.7 m。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。,革兰氏染色法,革兰氏染色法是细菌学广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。,）涂片固定。,）草酸铵结晶紫染1分钟。,）自来水冲洗。,）加碘液覆盖涂面染1分钟。,）水洗，用吸水纸吸去水分。,）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。,）蕃红染色液染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。,染色的结果，,革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。,下面是革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌。,革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。,下面是革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌。,和革兰氏阳性杆菌。,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性杆菌。,志贺氏菌扫描电镜照片,志贺氏菌扫描电镜照片,志贺氏菌的透射电镜照片,2、志贺氏菌的培养特性,需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。,37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2mm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。,在液体培养基中呈,均匀浑浊生长，无菌膜形成,。,菌落形态学Bacterial Colony Morphology-,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,细菌在肉汤培养基中的生长,1.uniform turbidity,or diffuse growth2.flocculent(clumps)3.sediment,and4.ring or pellicle,growth on surface,3、志贺氏菌的生化特性,本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。,大多不发酵乳糖,，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。,靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S,。根据生化反应可进行初步分类。,志贺氏菌生化反应分类,志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。,A、,不分解甘露醇组,：,主要为志贺氏菌,。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。,B、,分解甘露醇组,：,包括福氏、鲍氏、宋内氏菌,。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类。,4、志贺氏菌的抗原构造与分型,志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。,型特异性抗原、群特异性抗原、表面抗原（K抗原）。,根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、45个血清型（包括亚型）,附：,志贺氏菌抗原分类。,志贺氏菌属抗原的分类,菌 名 血 清 分 类 生 化 特 性,群 型 亚 型 甘露醇 鸟氨酸脱羧酶,志贺氏菌 A 112 -,福 氏 菌 B 16,1a、1b、2a、2b、3a、3b,+-,x、y变种,3c、4a、4b.5a.5b,鲍 氏 菌 C 118 +-,宋内氏菌 D 1 +,志贺氏菌属抗原的分类,A群：也称志贺氏菌群，有12个血清型。不发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清学联系。,B群：也称福氏菌群，已有14个血清型（包括亚型和变种）。发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂，各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原，即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6群抗原。,C群：也称鲍氏菌群，有18个血清型，分解甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。,D群：也称宋内氏菌群，仅有一个血清型。分解甘露醇，有鸟氨酸脱羧酶，迟缓发酵乳糖。有、相之分。,5、志贺氏菌的抵抗力,志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。,一般在潮湿土壤中能存活34天，37水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-6010分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。,6、志贺氏菌的变异性,S-R型变异：菌落可由光滑型变为粗糙型，同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内，尤其在慢性患者和恢复期患者，志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性，成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时，对这类菌株要特别注意，必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。,耐药性变异毒力变异与其他变异,二、志贺氏菌的流行病学,人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。,志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播。,和志贺氏菌病相关的食品包括色拉（土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡），生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包，和有鳍鱼类。,志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。,食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。,三、志贺氏菌的致病性,志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10个细胞）进入，就有可能致病。,致病因素：,志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。,志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类:,A、急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。,B、慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。,免疫性：,病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。,四、志贺氏菌的检验,1、增菌,称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培养68h。,培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。,2、分离和初步生化试验,取增菌液1环，划线接种于,HE琼脂平板或SS琼脂平板,1个；另取1环划线接种于,麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各,1个，于36培养1824h。,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。,HE平板原理及反应,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。,发酵乳糖的某种肠杆菌,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。,SS平板原理及反应,大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,是沙门氏菌。有黑色中心。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。,麦康凯琼脂平板,EMB平板照片及原理,挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36培养1824h，分别观察结果。,动力试验,三糖铁（TSI）琼脂试验的原理,1.Pseudomonas aeruginosa：Motile 2.Staphylococcus aureus：Non-motile 3.Bacillus subtilis：Motile,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,互动,：,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。应该产生什么现象？,大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。应该是什么现象？,沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。,下述培养物可以弃去吗？,a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b.在1824h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d.产气的培养物；e.有动力的培养物；f.产生硫化氢的培养物。,凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。,3、血清学分型,挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。,先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；,如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。,如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用118各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。,4、进一步的生化试验,在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：,葡萄糖铵,西蒙氏柠檬酸盐,赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶,pH7.2尿素,KCN生长,水杨苷和七叶苷的分解,除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。,必要时还应做,革兰氏染色检查和氧化酶试验,，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。,已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做,5%乳糖发酵,甘露醇,棉子糖,甘油的发酵,靛基质试验,志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。,5、噬菌体裂解试验,噬菌体是寄生于细菌的病毒，它们随同细菌分布于自然界中，噬菌体对于它们的 宿主细菌具有一定的特异性。故可利用噬菌体来鉴定某些细菌且对于某种菌作为一个 必要的鉴定项目。噬菌体对于它们的宿主细菌还具有型的特异性，因此可用于细菌的分型。应用肠杆菌科噬菌体诊断法来检验食品及食物中毒中的沙门氏菌，志贺氏菌性大肠埃希菌，也适用于食品从业人员的带菌检验。,6、结果报告,综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。,