蛋白质组学及技术介绍.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,蛋白质组学,概念,蛋白质组是在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。,蛋白质组学是蛋白质组概念的延伸。是蛋白质的规模化研究，从蛋白质水平和生命本质层次上研究和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质，揭示基因活动的动态表达。,蛋白质水平的分析不仅为生物分子体系提供最有效的实时分析模型而且也获得了,DNA,和,RNA,水平上不易获得的信息。,研究内容,蛋白质的研究内容主要有两方面：,1,、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定,;,2,、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。,研究内容,蛋白质组学可分为三个主要领域：,1,、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰；,2,、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比较；,3,、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质,-,蛋白质相互作用。,研究技术,3,蛋白质分离策略：,1,、多维色谱法，包括大小排阻色谱法、离子交换色谱法、反相高效色谱法、疏水性相互作用色谱法等；,2,、多维电泳技术，包括,二维凝胶电泳法,、自由流动电泳法、毛细管区带电泳法等；,3,、亲合法，包括免疫印迹法、亲和捕获；,4,、细胞器，膜的复合体分离。,二维凝胶电泳法：,二维凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用,SDS-PAGE,分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。,2-DE,有较好的分辨率，,SDS-PAGE,或单相,IEF,的最好分辨率仅为,100,个蛋白，而,2-DE,大约为,3000,个蛋白。,蛋白质肽段的鉴定,:,1,、氨基和羧基末端分析，如：,Edman,2,、,质谱法,，包括肽片段的质谱和串联质谱法、,质谱法：,质谱（,mass spectrum,）是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带电荷的离子，这些离子按质荷比,m/z,（离子的质量,m,与其所带电荷,z,的比值）的大小被收集并记录程谱的方法。,生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（,M/E,）的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解,Lys,或,Arg,的,-C,端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离,-,飞行时间质谱（,MALDI-TOF-MS,）和电喷雾质谱（,ESI-MS,）。,蛋白质相互作用,1,、免疫共沉淀技术：,该技术以抗体和抗原之间的特异性结合为基础，不仅能够确定生理条件下细胞或组织内,2,种目标蛋白质是否存在相互作用，还可以探究与己知相互作用的蛋白。,它的基本原理是在非变性条件下裂解细胞，保留细胞内相互作用的蛋白质，将目的蛋白的抗体加入细胞裂解液中，使目的蛋白在体内的相互作用蛋白成电下来。经过洗脱，收集沉淀物并进行分离，最后对分离所获得蛋白进行鉴定。,该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的蛋白质间相互作用,蛋白质相互作用,2,、酵母双杂交系统：,该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，,DN A,结合结构域,(binding domain,BD),识别,DNA,上的特异序列并使转录激活结构域,(activation domain,AD),启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白,X,和待研究蛋白,Y,的基因分别与编码,AD,和,BD,的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表达，生成两个融合蛋白。若蛋白,X,和,Y,可以相互作用，则,AD,和,BD,在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告基因,;,反之，如果,X,和,Y,之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样，通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。,蛋白质相互作用,3,、蛋白质芯片技术,蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，能够进行高通量的蛋白功能分析。该技术实现的基础是蛋白探针在固相支持物,(,载体,),表而的大规模集成，利用样品中标记或未经标记的靶蛋白分子与探针进行反,应，然后通过荧光法、放射性同位素法或无标记检测法等相应的方法进行检测，最后由计算机分析结果，获得高丰度表达蛋白。,蛋白质组学的应用,疾病研究 植物学,药物研究 食品科学,遗传病学 微生物学,在疾病及药物研究中的应用,1.,发现新的疾病标志物，鉴定疾病相关蛋白质作为早期临床诊断标志。,例如：Lei等通过2-DE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱等蛋白质组学相关技术对膀胱癌患者的尿蛋白进行分离鉴定，获得14个差异表达的蛋白质，这些差异表达的蛋白可能是诊断和检测膀胱癌的潜在尿标志物,。,在疾病及药物研究中的应用,2.探索疾病的发病机制和治疗途径。,例：Polprasert等应用蛋白质组学方法对遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜蛋白变化进行研究，分离鉴定出56个差异表达的蛋白质，通过蛋白质网络分析出包括细胞死亡、细胞循环及遗传性和血液性紊乱3个HS相关的重要网络，为进一步研究和了解HS相关的发病机制提供了参考。,在疾病及药物研究中的应用,3.研究膜蛋白及膜相关蛋白,Liu等利用比较膜蛋白组学方法对H5N1病毒分别感染6,12,14h的人肺腺癌细胞A549进行蛋白分析鉴定，得到24个差异表达的蛋白质，其中57%为膜蛋白或膜相关蛋白，通过siRNA技术鉴定出与病毒增殖相关的几种蛋白质。,在疾病及药物研究中的应用,4、为快速，特异，高通量的药物研究提供了技术支持。,Lin等应用蛋白质组学技术对阿霉素处理的人子宫癌细胞的蛋白表达变化进行研究发现，有 37 种差异表达的蛋白质，为阿霉素抗性的子宫癌细胞的治疗提供了诊断和治疗标志物。,蛋白质组学的研究技术,蛋白质分离技术：双向凝胶电泳（2DE），双向荧光差异电,泳,（2D-DIGE），等电聚焦电泳（IEF）,液相色谱。,多维色谱（MDC），多维液相色谱（MDLC）,蛋白质鉴定技术,一级质谱：根据离子源的不同，分为基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS）。二级质谱：肽质量指纹图谱（PMF）。,新技术：稳定同位素特征标签生物质谱(SIAMS),iTRAQ,定义：,同位素标记相对和绝对定量,(isobaric tags for relative and absolute quantitation,，,iTRAQ),技术由,AB SCIEX,公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽,N,末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达,8,种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。,原理：,iTRAQ,技术采用,4,种或,8,种,同位素编码的标签,，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行,串联质谱分析,，可同时比较,4,种或,8,种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。,iTRAQ,试剂,iTRAQ,试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：,1.,一端是报告部分,reporter group,2.,另一端是肽反应部分,peptide reactive group,3.,中间部分是平衡部分,balance group,reporter group,：质量为,114Da,、,115 Da,、,116 Da,、,117Da,，因此,iTRAQ,试剂共四种；,peptide reactive group,：将,reporter group,与肽,N,端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质；,balance group,：质量为,31 Da,、,30 Da,、,29 Da,、,28 Da,，使得四种,iTRAQ,试剂分子量均为,145 Da,，保证,iTRAQ,标记的同一肽段,m/z,相同。,iTRAQ,试剂结构,iTRAQ,试剂标记原理,4,个来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同,;Balance group,在二级质谱发生中性丢失,;Reporter group,在二级质谱产生个报告离子，分别是,114,、,115,、,116,和,117;,通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达量比值,.,操作流程,仪器,TripleTOF,TM,5600+,系统是快速评估药物代谢稳定性、药物在体内特征和最终代谢产物鉴定的理想平台。在最快采集速度条件下，用高分辨和准确质量质谱数据，完成无与伦比的蛋白质定性鉴定工作。,技术特点,定量精确：,每组平行比较多达,8,个样本，标记效率高达,97%,，可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差。,高效率样品分离：,进行,SCX-HPLC,分离，实现自动化操作。,高鉴定率：,系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达,6000,种蛋白。,适用范围广：,无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。,iTRAQ,技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。,仪器性能优良：,基于高分辨率（大于,105,）、高质量精度（小于,1ppm,）质谱平台，可获得更加准确的结果。,iTRAQ,技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于,10KD,或大于,200KD,的蛋白。,荧光差异凝胶电泳,原理,在二维电泳的基础上进行荧光标记,特点,DIGE荧光差异蛋白表达分析系统在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。,实验流程,仪器,荧光差异凝胶电泳系统,Ettan DIGE 2D,试剂,1,.,样品标记,（1）染料,Cy2,Cy3,Cy5,与蛋白的赖氨酸的epsilon-氨基反应，产生三种带正电荷的荧光基团，在不同波长光激发下产生荧光。,2.一相等点聚焦,（2）IPG胶条水化液,（3）分离胶缓冲液,（4）平衡缓冲液,（5）溴酚蓝溶液,成分,终浓度,尿素,8 M,CHAPS,2%,DTT,15 mM,IPG,buffer 0.5%,4x 分离胶缓冲液,1.5M Tris-HCl,pH8.8 和 0.4%（w/v）SDS：45.5g Tris 和 1g SDS 溶于 200ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.8，最后用去 离子水将体积补足到 250ml，加入 25mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4C 储存两周。,平衡缓冲液,0.05 M Tris-HCl,pH 8.8，6 M 尿素,30%(w/v)甘油和 2%(w/v)SDS：180 g 尿素,150 g 甘油,10 g SDS 和 16.7 ml 分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将 体积补足到 500ml。此种缓冲液可于室温下保存两周。,溴酚蓝溶液,0.25%(w/v)溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中25 mg 溴酚蓝溶于 10 ml 分离胶缓冲液中，4C 储存。,平衡缓冲液包括 6 M 尿素和 30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入 DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的 DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾point streaking),。,3.二相SDS-PAGE,丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液,（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到 1000ml。过滤后可于 4C 储存两周,。,分离胶缓冲液,（1.5M Tris-HCl,pH8.6 和 0.4%（w/v）SDS）90.85gTris 和 2gSDS 溶于 400ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.6，最后用去离子水将体积补足到 500ml，加入 50mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4C 储存两周。,10%（w/v）过硫酸铵溶液,1g 过硫酸铵溶于 10ml 去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。,覆盖液,（缓冲液饱和的异丁醇）：混合 20ml 上述分离胶缓冲液和 30ml 异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。,取代液,（50%(v/v)甘油和 0.01%溴酚蓝水溶液）：混合 250ml 甘油（100%）和 250ml 去离子水，再加入 50mg 溴酚蓝，搅拌几分钟。,低熔点琼脂糖溶液,含有 0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。,