DNA测序-化学降解法名师优质课获奖市赛课一等奖课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,DNA,序列测定,第1页,脱氧,核糖,含氮碱基,磷酸,A,G,C,T,DNA,基本单位,脱氧核苷酸,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,第2页,DNA,测序：测定未知序列,确定重组,DNA,方向与结构,对突变进行定位和判定,比较研究,第3页,成熟,DNA,测序技术始于,20,世纪,70,年代中期。,1977,年,Maxam,和,Gilbert,报道了经过,化学降解,测定,DNA,序列方法。,同一时期,Sanger,创造了双脱氧链终止法,20,世纪,90,年代初出现荧光自动测序技术将,DNA,测序带入自动化测序时代。,这些技术统称为第一代,DNA,测序技术。,第4页,第二代测序技术,第5页,三种第二代测序技术对比,测序技术,454,Solexa,SOLiD,上市时间,价格（万美元，）,50,45,59,单次反应数据量,0.4,20,50,读长（,bp,）,400,50*2,50,优势,长读长,低测序成本，,高性价比,高通量，,高准确度,第6页,第三代测序技术,第二代测序技术在制备测序文库时候都需要经过,PCR,扩增，而这一,PCR,过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子百分比关系。另外，第二代测序读长普遍偏短，在进行数据拼接时会碰到麻烦。为了克服这么缺点，业界发展出了,以单分子实时测序和纳米孔为标志第三代测序技术。,第7页,Maxam-Gilbert DNA,化学降解法,基本原理,：,直接或间接特异性识别,4,种碱基,特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处,(5,或,3),打断磷酸二酯键,将一个 DNA 片段 5 端磷酸基作放射性标识，再分别采取不一样化学方法,修饰和裂解,特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端,被标识 DNA 片段,，这些以特定碱基结尾片段群经过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目标 DNA 碱基序列。,操作步骤,将双链,DNA,样品变为单链,每个单链同一方向末端都用放射性同位素标识,方便显示,DNA,条带,分别用不一样方法处理,取得只差一个核苷酸降解,DNA,群体,电泳,读取,DNA,核苷酸次序,第8页,第9页,先用限制性内切酶把,DNA,切成,10,200,bp,测序材料；,用,碱性磷酸化酶,处理该片段，消除,5,末端上磷酸；,在,5OH,端标识,32,P,，用,多核苷酸磷酸激酶,催化；,标识片段变性为单链；,用,特异化学试剂,作用于不一样碱基进行修饰，然后用,哌啶甲酸,切断反应碱基多核苷酸链，紧接着用四组不一样,特异反应,能够使末端标识,DNA,分子切成不一样长度片段，,产生一组其末端都是该特异碱基长度不等,DNA,片段；,经电泳和放射性自显影后，从,4,个反应系统统一阅读，待测,DNA,全部核苷酸序列就可直接读出,第10页,该反应关键在于使,DNA4,种核苷酸中，只有,1-2,种发生特异性化学切割反应：,碱基特异性修饰；,修饰碱基从核糖环上转移；,失去碱基糖环部位发生,DNA,链断裂。,专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键化学试剂有硫酸二甲酯（,dimethylsulphate),和肼,(hydrazine),、哌啶甲酸等。,第11页,肼,，,又称联氨,NH,2,.NH,2,在碱性环境中作用于胞嘧啶,C,和胸腺嘧啶,TC,4,和,C,6,位置造成糖苷键断裂。,假如加入高浓度盐（,1.5M NaCl,），肼则主要作用于胞嘧啶,C,使之断裂。,在高温强碱作用,(90,1.2M NaOH),下可使腺嘌呤,A,位点发生猛烈断裂反应,但对胞嘧啶,C,反应较弱,哌啶甲酸,(90,1mol/L),在修饰位点两端使,DNA,糖,-,磷酸链断裂,胞嘧啶,胸腺嘧啶,第12页,硫酸二甲酯,dimethyl sulphate,，,DMS,，（,CH,3,O,）,2,SO,2,：,一种碱性化学试剂，能够使,DNA,链上腺嘌呤,AN,2,和鸟嘌呤,GN,甲基化，不过,鸟嘌呤,GN,甲基化速度比腺嘌呤,AN,2,甲基化速度要快,4-10,倍,，而且在中性,pH,环境中，,DMS,主要作用于鸟嘌呤,G,，使之甲基化，造成糖苷键断裂。,热哌啶,：,使,DNA,链上嘌呤在酸作用下发生糖苷水解，造成,DNA,链在脱嘌呤位点（,G,和,A,）发生断裂。,第13页,DNA,化学降解反应体系,反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂,断裂点,G,硫酸二甲酯,鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶,G,G+A,甲酸,脱嘌呤作用 六氢吡啶,G,和,A,C+T,肼,嘧啶开环 六氢吡啶,C,和,T,C,肼（加盐）,胞嘧啶开环 六氢吡啶,C,DMS,（硫酸二甲酯）在,中性,pH,环境，主要,作用于,G,，被六氢吡啶作用而造成该位点上,DNA,链断裂。,甲酸,含有脱嘌呤作用。,DNA,链在脱嘌呤位点,(G,和,A),发生断裂。,肼,，在,碱性条件下，作用于,T,胸腺嘧啶和,C,胞嘧啶,，在含有六氢吡啶条件下，造成在这个核苷酸位置上发生,DNA,链断裂。假如在反应体系中加入,高浓度盐,，同胸腺嘧啶反应速率便会下降，主要作用于,C,胞嘧啶,。,A C,肼,90,C,NaOH(1.2M),断裂反应,第14页,在,4,种反应体系中，化学试剂特异地断裂,DNA,机制是：,G+A,反应,-,（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。,G,反应,-,硫酸二甲酯（,DMS,）使,GN7,甲基化，其后断开了,C8-C9,间化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。,T+C,反应,-,肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。,C,反应,-,在,NaCl,存在时，只有,C,才能与肼发生反应，随即，被修饰胞嘧啶被哌啶置换。,第15页,在,4,种反应体系中，化学试剂特异地断裂,DNA,机制是：,G+A,反应,-,（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，减弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。,G,反应,-,硫酸二甲酯（,DMS,）使,GN7,甲基化，其后断开了,C8-C9,间化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖结合。,T+C,反应,-,肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。,C,反应,-,在,NaCl,存在时，只有,C,才能与肼发生反应，随即，被修饰胞嘧啶被哌啶置换。,第16页,第17页,哌啶,第18页,5 GATCACTACTG 3,标识,5,*,GATCACTACTG 3,G,：,DMS,C,：肼（加盐）,G+A,：甲酸,C+T,：肼,5-,*,GATCACTACTG,5-,*,G,G,5-,*,GATCACTACTG,5-,*,GATCACTA,5-,*,GATCA,5-,*,GA,5-,*,G,5-,*,GATCACTAC,5-,*,GATCACT,5-,*,GATCAC,5-,*,GATC,5-,*,GAT,5-,*,GATCACTACT,5-,*,GATCACTACTG-,5-,*,GATCACTAC,5-,*,GATCAC,5-,*,GATC,-,*,GATCACTACTG-,第19页,在化学修饰反应过程中，经过,控制反应温度和反应时间,，只有,一小部分碱基被修饰,(,而不是全部被修饰,),，随即进行断裂反应也是,定量反应,。所以，,DNA,链并不是在全部可被修饰碱基位点断裂，而是,随机断裂,。在,4,个反应中，产生,4,套带相同标识末端、长短不一寡聚核苷酸片段。,只有带标识末端片段可被识别,，没有标识末端片段能够忽略不计。,第20页,、,在化学修饰反应过程中，经过,控制反应温度和反应时间,，只有,一小部分碱基被修饰,(,而不是全部被修饰,),，随即进行断裂反应也是,定量反应,。所以，,DNA,链并不是在全部可被修饰碱基位点断裂，而是,随机断裂,。在,4,个反应中，产生,4,套带相同标识末端、长短不一寡聚核苷酸片段。,只有带标识末端片段可被识别,，没有标识末端片段能够忽略不计。,第21页,第22页,电泳和读谱,详细测定过程中，首先将,3,端或,5,端双链,DNA,溶解在总体积为,50L,、分别含有,0.03mol/LNaOH,、,10%,甘油、,1mmol/L EDTA,、,0.05%,二甲苯蓝和,0.05%,溴甲酚蓝溶液中，使双链,DNA,变性。然后加到由,5%10%,丙烯酰胺、,0.16%0.33%,双丙烯酰胺、,50mmol/LTris-,硼酸、,pH8.31mmol/L EDTA,组成凝胶板上，进行电泳和放射性自显影等处理，制得一端带标识单链,DNA,。,第23页,电泳检测,-310,第24页,步骤：毛细管灌胶,第25页,步骤：样品盘移动,第26页,步骤：电进样及电泳,第27页,步骤：荧光激发及检测,第28页,化学法读序方法,化学法测序放射自显影图谱识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性，每组测序图谱为,4,或,5,条垂直阶梯带，,AC,反应能够不做。该片从胶底部一个个向顶部读，,G+A,和,C+T,两列中含有全部相差一个碱基,DNA,片段。,假如,G+A,中出现,1,条带就看,G,列中是否有一样大小带，若有即为,G,碱基，无则为,A,碱基；同理，,C+T,中则检验,C,列中有没有一样大小条带，有即为,C,，无则为,T,。,在做了,AC,反应时，出现较深带时，能够帮助确定为,A,碱基。化学法必须,4,或,5,个反应管统一阅读，,DNA,中,4,个碱基每个位置都有,1,个对应片段，待测,DNA,全部序列可直接读出。,化学法测序采取,32,P,标识,DNA,进行，条带会较末端法更含糊，更宽，因为分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为,200-300bp,以内。,第29页,聚丙烯酰胺凝胶电泳将,DNA,链按长短分开,依据放射自显影显示区带，直接读出,DNA,核苷酸序列。,假如,G+A,中出现,1,条带就看,G,列中是否有一样大小带，若有即为,G,碱基，无则为,A,碱基；同理，,C+T,中则检验,C,列中有没有一样大小条带，有即为,C,，无则为,T,。,第30页,在做了,AC,反应时，出现较深带时，能够帮助确定为,A,碱基。,第31页,DNA,序列测定应用,1),测序,PCR,克隆测序验证,突变体检测,新基因测序,全基因组测序,系统发育及物种判定,2),片段分离,个体识别：亲缘判定,SNP,关联分析,疾病诊疗等,第32页,Maxam-Gilbert,化学降解法测序长度约,250bp,优点：,不需要进行酶催化反应，所以不会产生因为酶催化反应而带来误差；对未经克隆,DNA,片段能够直接测序；化学降解测序法尤其适合用于测定含有如,5-,甲基腺嘌呤,A,或者,G,，,C,含量较高,DNA,片段，以及短链寡核苷酸片段序列。化学降解测序法既能够标识,5-,末端，也能够标识,3-,末端。假如从两端分别测定同一条,DNA,链核苷酸序列，相互参考测定结果，能够得到准确,DNA,链序列。,第33页,没有改进,操作繁琐,化学试剂毒性大,放射性同位素标识效率偏低以致需要较长放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费劲,.,当前,仅在分析特殊,DNA,链核苷酸序列和分析,DNA,和蛋白质相互作用中,DNA,一级结构时才使用,缺点：,第34页,谢谢大家,!,第35页,