酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物细胞,取得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等,培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等,植物细胞,取得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织方法,培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在次级代谢物生产过程中通常采取液体悬浮培养。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第1页,第一节 植物细胞培养产酶,植物是各种色素、药品、香精和酶等天然产物主要起源：,当前已知天然化合物超出,30 000,种,其中,80%,以上来自于植物,;,从植物中得到最普遍又必不可缺药品有,17,类,我国普遍使用中草药及其制剂,80%,以上起源于植物,美国每年使用植物起源药品超出,30,亿美元,;,全世界每年使用植物起源芳香化合物价值超出,15,亿美元。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第2页,研发历史,1902,年,哈勃兰德,(Haberlandt),首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株构想,100,年来,伴随培养基研制和培养技术发展,已经从,200,各种植物中分离出细胞,不但能够经过细胞再分化生成完整植株,而且能够经过细胞培养,取得,400,各种人们所需各种物质。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第3页,20,世纪,80,年代以后，植物细胞培养技术快速发展,已成为生物工程研究开发新热点。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第4页,主要内容,1.,植物细胞特点,2.,植物细胞,培养,特点,3.,植物细胞培养工艺条件及其控制,植物细胞培养工艺流程,植物细胞培养培养基,4.,植物细胞培养产酶工艺过程,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第5页,一、植物细胞特点,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第6页,植物细胞结构,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第7页,动物细胞模式图,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第8页,植物、动物、微生物细胞特征比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小,/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间,/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药品、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、多肽药、酶等,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第9页,三者之间差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞营养要求较简单。,植物细胞生长以及次级代谢物生产要求一定光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞主要目标产物各不相同。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第10页,二、植物细胞,培养,特点,植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或,D N A,重组等技术而取得优良植物细胞。然后,在人工控制条件植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而取得各种所需产物。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第11页,植物细胞培养生产各种天然产物,与从植物中提取分离这些物质相比,含有以下显著特点。,1.,提升产率,2.,缩短周期,植物细胞生长倍增时间普通为,12,60h,普通生产周期,15,30,天。,3.,易于管理,减轻劳动强度,不受地理环境和气候条件等影响。,4.,提升产品质量,主要产物产率较高,杂质较少；,降低环境中有害物质污染和微生物、昆虫等侵蚀；,产物易于分离纯化。,5.,其它,对剪切力敏感、生产周期长等缺点；,许多植物细胞生长和代谢需要一定光照。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第12页,三、植物细胞培养工艺条件及其控制,（一）植物细胞培养工艺流程,普通为：,外植体,-,细胞获取,-,细胞培养,-,分离纯化,-,产物,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第13页,1.,外植体选择与处理,外植体,：指从植株取出,经过预处理后,用于植物组织和细胞培养植物组织,(,包含根、茎、叶、芽、花、果实、种子等,),片段或小块。,选择,：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则植株,假如植物细胞是用于生产次级代谢物,则需从产生该次级代谢物组织部位中切取一部分组织,经过清洗,除去表面灰尘污物。,操作,：将上述外植体切成,0.5,1c m,左右片段或小块,用,70%,75%,乙醇溶液或者,5%,次氯酸钠、,10%,漂白粉、,0.1%,升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗,以除去残留消毒剂。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第14页,2.,植物细胞获取,直接分离法,愈伤组织诱导法,原生质体再生法,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第15页,直接分离法,:,植物细胞能够直接从外植体中分离得到。分为,机械法,和,酶解法,两种,。,1,）,机械捣碎法分离植物细胞,是先将叶片等外植体轻轻捣碎,然后经过过滤和离心分离细胞。,优点,:,取得植物细胞没有经过酶作用,不会受到伤害,;,不需要经过质壁分离,有利于进行生理和生化研究。,缺点：因为受到机械作用,细胞结构会受到一定伤害,取得完整细胞团或细胞数量少,其使用不普遍。,2,）,酶解法分离细胞,是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体,分离出含有代谢活性细胞。该法不但能降解中胶层,而且还能软化细胞壁。,所以,用酶解法分离细胞时候,必须对细胞给予渗透压保护,如甘露醇等,。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第16页,愈伤组织诱导法,愈伤组织,是一个能快速增殖无特定结构和功效薄壁细胞团。,经过愈伤组织诱导法取得植物细胞,基本过程,:,将选择好含有一定量生长素和分裂素液体培养基加入,0.7%,0.8%,琼脂,制成半固体愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后,将上述外植体植入诱导培养基中,于,25,左右培养一段时间,即从外植体切口部位长出小细胞团,此细胞团称之为愈伤组织。普通培养,1,3,周后,将愈伤组织分散接种于新半固体培养基中进行继代培养,以取得更多愈伤组织。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第17页,原生质体再生法,原生质体再生法,:,原生质体,(protoplast),是除去细胞壁后得到微球体。,植物原生质体,取得：,可从培养植物单细胞、愈伤组织和植物组织、器官中取得。,分离方法：,机械分离法和酶解法两种,普通都采取,酶解法,。,酶解法：,植物细胞细胞壁基本成份是纤维素、半纤维素和果胶物质。为使细胞壁降解释放原生质体,必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解酶制剂,最惯用有纤维素酶和果胶酶混合物。,在原生质体制备过程中,为了预防原生质体被破坏,普通要采取用高渗溶液,以利于完整原生质体释放。配制高渗溶液溶质称为渗透压稳定剂。惯用渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。,原生质体分离后,经过计数和适当稀释,在一定条件下进行原生质体培养,使细胞壁再生,而形成单细胞悬浮液。,细胞壁再生后得到植物单细胞,经过单细胞培养,长成细胞团,再经过继代培养,形成由原生质体形成细胞系。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第18页,3.,细胞悬浮培养,将上述取得植物细胞在无菌条件下,转入新液体培养基,在人工控制条件生物反应器中,进行细胞悬浮培养,取得所需产物。,4.,分离纯化,细胞培养完成后,分离搜集细胞或者培养液,再采取各种生化技术,从细胞或者培养液中将各种物质分离,得到所需产物。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第19页,水稻外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第20页,（二）植物细胞培养培养基,1.,培养基特点,(1),植物细胞生长和代谢需要大量无机盐:P、S、N、K、N a、,Ca,、,M g,等大量元素（,102,3103 m g/L,）；,M n,、,Zn,、,Co,、,M o,、,C u,、,B,、,I,等微量元素（,10-2,30 m g/L,）。,(2),植物细胞需要各种维生素和植物生长激素,:,如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。,培养液中维生素浓度普通为,0.1,100 m g/L(,表,2-9);,而植物生长激素浓度普通为,0.1,10 m g/L,(3),植物细胞要求氮源普通为无机氮源,:,即能够同化硝酸盐和铵盐。,(4),植物细胞普通,以蔗糖为碳源,:,蔗糖浓度普通为,2%,5%,。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第21页,2.,几个惯用植物细胞培养基,MS,培养基（,LS,和,RM,培养基,）,B5,培养基,White,培养基,KM-8 P,培养基,应用最广是,MS,培养基和,LS,培养基,MS,培养基是,1962,年由,Murashinge,和,Skoog,为烟草细胞培养而设计培养基。,LS,、,RM,培养基是在其基础上演变而来。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第22页,3.,植物细胞培养基配制,将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶液和植物激素溶液等几个大类,先配制成,10,倍或者,100,倍浓度母液,放在冰箱保留备用。在使用时,吸收一定体积各类母液,按照百分比混合、稀释,制备所需培养基。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第23页,(,三,),温度控制,植物细胞培养温度普通控制在室温范围,(25,左右,),。温度高些,对植物细胞生长有利,温度低些,则对次级代谢物积累有利。不过通常不能低于,20,也不要高于,35,。,有些植物细胞最适生长温度和最适产酶温度有所不一样,要在不一样阶段控制不一样温度。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第24页,(,四,)pH,值控制,植物细胞,p H,值普通控制在微酸性范围,即,pH 5.0,6.0,。培养基配制时,pH,值普通控制在,5.5,5.8,范围,在植物细胞培养过程中,普通,p H,值改变不大。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第25页,(,五,),溶解氧调整控制,植物细胞生长和产酶需要吸收一定溶解氧。,溶解氧普通经过通风和搅拌来供给。,适当通风、搅拌还能够使植物细胞不至于凝集成较大细胞团,以使细胞分散,分布均匀,有利于细胞生长和新陈代谢。然而,因为植物细胞代谢较慢,需氧量不多,过量氧反而会带来不良影响。加上植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感,所以通风和搅拌不能太强烈,以免破坏细胞。这在植物细胞反应器设计和实际操作中,都要给予充分注意。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第26页,(,六,),光照控制,大多数植物细胞生长以及次级代谢物生产要求一定波长光照射,并对光照强度和光照时间有一定要求,而有些植物次级代谢物生物合成却受到光抑制。,在植物细胞培养过程中,应该依据植物细胞特征以及目标次级代谢物种类不一样,进行光照调整控制,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第27页,(,七,),前体添加,前体,是指处于目标代谢物代谢路径上游物质。,为了提升植物细胞培养生产次级代谢物产量,在培养过程中添加目标代谢物前体是一个有效办法。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第28页,(,八,),刺激剂应用,刺激剂,(elecitor),能够促使植物细胞中物质代谢朝着一些次级代谢物生成方向进行,从而强化次级代谢物生物合成,提升一些次级代谢物产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当刺激剂能够显著提升一些次级代谢物产量。,惯用刺激剂：,微生物细胞壁碎片,和,果胶酶,、,纤维素酶,等微生物胞外酶。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第29页,四、植物细胞培养产酶工艺过程,以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（,SOD,）为例,(1),大蒜愈伤组织诱导,选取坚固、饱满、无病虫害大蒜蒜瓣，去除外皮，先用,70%,乙醇消毒,20s,，再用,0.1%,升汞消毒,10min,，然后无菌水漂洗,3,次。,在无菌条件下，切成,0.5cm,3,小块，植入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,半固体,MS,培养基中，在,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下培养,18d,，诱导得到愈伤组织，每,18,天继代一次。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第30页,(2),大蒜悬浮细胞培养,将上述在半固体,MS,培养基上培养,18d,愈伤组织，在无菌条件下转入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,（苄基腺嘌呤）液体,MS,培养基中，加入灭菌玻璃珠，,25,，,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。,然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有,3mg/L 2,4-D,和,1.2mg/L 6-BA,液体,MS,培养基中，,25,600lux,，,12h/d,光照条件下震荡培养,18d,。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第31页,(3),酶分离纯化,细胞培养完成后，搜集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,超氧化物歧化酶,(S O D),：,是催化超氧负离子进行氧化还原反应氧化还原酶,含有抗辐射、抗氧化、抗衰老功效。,S O D,能够从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第32页,第二节 动物细胞培养产酶,动物细胞培养是在,20,世纪,50,年代,伊尔勒,(Earle),等人开始进行病毒疫苗细胞培养基础上,于,20,世纪,60,年代快速发展起来技术。,1967,年 开发适合动物细胞贴壁培养微载体技术,1975,年 创造杂交瘤技术,有力地推进了动物细胞培养技术发展。,已经在疫苗、激素、多肽药品、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功效性蛋白质生产中广泛应用,工业化生产到达,20 000 L,甚至更大规模,已经成为生物工程研究开发主要领域。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第33页,1.,动物细胞特征,(1),在于没有细胞壁,(2),动物细胞体积比微生物细胞大几千倍,稍小于植物细胞体积。,(3),大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在,在细胞培养中大部分细胞含有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功效全能性。,(4),动物细胞营养要求较复杂,必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中普通需要加进,5%,10%,血清。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第34页,2.,动物细胞培养特点,主要用于各种功效蛋白质生产。,细胞生长速度慢。（需添加抗生素）,细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。,反应过程成本高，产品价格贵。,大多数细胞含有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细胞可采取悬浮培养。,动物细胞培养基成份较复杂,普通要添加血清或其代用具,产物分离纯化过程较繁杂,成本较高。,原代细胞普通繁殖,50,代。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第35页,3.,培养方法,(1),悬浮培养,来自血液、淋巴组织细胞,肿瘤细胞和杂交瘤细胞,(2),贴壁培养,存在于淋巴组织以外组织、器官中细胞（成纤维细胞、上皮细胞等）；采取,滚瓶培养系统,、,微载体系统,。,(3),固定化细胞培养,（,锚地依赖性和非锚地依赖性,细胞；,吸附法和包埋法,）,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第36页,4.,培养基组成与配置,动物细胞培养基组分较为复杂,包含,氨基酸,、,维生素,、,无机盐,、,葡萄糖,、,激素,、,生长因子,等。,首先配制各类母液,如,100,倍浓度氨基酸母液、,1000,倍浓度维生素母液、,100,倍浓度葡萄糖母液,(,溶解于平衡盐溶液,),等,;,在使用前,分别吸收一定体积母液,混匀得到混合母液,膜过滤除菌后,冷冻备用,;,使用时,取一定体积混合母液,用无菌平衡盐溶液稀释至所需浓度。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第37页,5.,培养条件影响与控制,（,1,）温度：普通控制在,36.5,，波动范围,0.25,.,（,2,）,pH,值：普通控制在,pH7.0-7.6,微碱性范围内（最优,pH7.4,）。,调整,pH,值,通常采取,CO,2,和,NaHCO,3,溶液；维持,pH,值稳定,通常在培养液中加入缓冲系统；惯用酚红监控,p H,值,（,蓝红色为,pH7.6,红色为,pH7.4,橙色为,pH7.0,黄色为,pH6.5,）。,（,3,）渗透压,:,应与细胞内渗透压相同。,（,4,）溶解氧：依据情况随时调整,。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第38页,6.,动物细胞培养产酶工艺过程,经过动物细胞培养取得酶主要有胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例,说明动物细胞培养产酶工艺过程及其控制。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第39页,工艺过程：,1.,人黑色素瘤细胞培养基（,Eagle,培养基）,2.,人黑色素瘤细胞培养,(1),将人黑色素瘤种质细胞用胰蛋白酶消化处理,分散,用,p H 7.4,磷酸缓冲液洗涤,计数,稀释成细胞悬浮液。,(2),在消毒好反应器中装进一定量培养液,将上述细胞悬浮液接种至反应器中,接种浓度为,(1,3)103,个细胞,/ml,于,37,CO2,培养箱中,通入含,5%CO,2,无菌空气,培养至长成单层致密细胞。,(3),倾去培养液,用,pH7.4,磷酸缓冲液洗涤细胞,2,3,次。,(4),换入一定量无血清,Eagle,培养液,继续培养。,(5),每隔,3,4,天,取出培养液进行,tPA,分离纯化。,(6),然后再向反应器中加入新鲜无血清,Eagle,培养液,继续培养,以取得大量,tPA,。,3.,组织纤溶酶原活化剂分离纯化,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第40页,组织纤溶酶原活化剂,(tissue plas minogen activator,tPA),是一个,丝氨酸蛋白酶,它能够催化纤溶酶原水解,生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中血纤维蛋白水解,对血栓性疾病有显著疗效。,纤溶酶原激活剂依据其结构和特征不一样,能够分为,组织纤溶酶原激活剂,(tissue plas minogen activator,tP A),和,尿激酶纤溶酶原激活剂,(urokinase plasminogenactivator,uP A),两种。现在国内外应用都是组织纤溶酶原激活剂。,1983,年,彭尼卡,(,Pennica),采取,克隆技术,将人,tPA,基因转入大肠杆菌细胞并得到表示。随即在各种微生物和动物细胞中表示成功,现已成为销售量最大基因工程药品之一。,酶工程动植物细胞培养产酶专家讲座,第41页,