放射生物学2.电离辐射对DNA的损伤课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,电离辐射对DNA的损伤,1,电离辐射对DNA的损伤,近年来，随着分子生物学技术与理论的飞速发展、有关,生物大分子的辐射效应,研究亦不断深入。,电离辐射所致生物大分子结构与功能的变化是,整个机体、各种组织，细胞乃至亚细胞水平上,的辐射生物效应的基础。它从微观角度反映了辐射敏感性的本质为探讨和解决宏观领域中的实际问题提供了依据。,可以认为，对,生物大分子辐射效应的研究,，将成为目前和今后一段时间内放射生物学领域的重点和前沿课题。,2,细胞要成功地行使其职能，并且把它所包含的遗传信息正确无误地传递给子代，完全依赖于每一个,脱氧核糖核酸分子(DNA),保持结构的完整。,核苷酸序列的改变，组成DNA双螺旋结构的碱基或糖在结构上的变动，都会干扰细胞基因组的复制或转录。,DNA的损伤,是辐射生物效应的主要原因(包括细胞死亡，丧失再增殖能力，突变等)。,电离辐射对DNA的损伤,3,因此，DNA损伤后的修复机制至关重要，修复过程会导致完全,恢复原状或错误修复,，后者将导致严重的实际后果，如致癌作用。,DNA是染色体的主要构成要素，而染色体则是把遗传信息传递给子细胞的工具。,染色体损伤或畸变是细胞群体受损的一种很好的指征，并有助于预测辐射效应。,电离辐射对DNA的损伤,4,主要内容,正常,DNA,分子,结构,辐射所致,DNA,损伤的,类型,DNA,损伤的生物学,意义,DNA,辐射损伤的,修复,5,正常DNA分子结构,DNA是一个由4种单位组成的双螺旋大分子,：,嘌呤碱基,腺嘌呤（A）,和,鸟嘌呤（G）,嘧啶碱基,胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）,6,正常DNA分子结构,和碱基相连接的一个糖分子（脱氧核糖），和糖相连接的一个磷酸分子。,核苷酸通过连接糖和磷酸分子的磷酸二酯键结合在一起。,DNA是由碱基间的氢键相连的两条互补链相成。,7,正常DNA分子结构,腺嘌呤与胸腺嘧啶配对,（,A：T碱基对,）,，鸟嘌呤与胞嘧啶配对,（G：C碱基对）,，使DNA的一条链具有另一条链的互补序列。,8,9,10,正常DNA分子,结构,DNA很像一架旋梯，两边柱子由两条链组成，而台阶是由氢键连接的碱基组成，两条链以双螺旋形式盘旋在一起。,DNA复制期间两条链则解旋分离，每条链都可作为合成新的互补链的模板。,11,辐射所致DNA损伤的类型,DNA链,断裂,（单链、双链）,DNA,碱基,损伤,DNA,交联,12,DNA链断裂,单链断裂（single strand break，SSB):在磷酸酯和脱氧核糖体之间的磷酸双酯键水平上发生，或者更经常是在碱基和脱氧核糖体之间的键水平上发生。,13,DNA链断裂,双链断裂,（double strand break，DSB)：包括DNA两条链相隔少于3个核苷酸的部位的断裂。,可以由单个粒子产生（传递能量约为300eV的电离辐射），或者由于两个粒子在第一个断裂有时间修复以前通过同一区域，从而在互补链中产生两个单链断裂组合而成。,假如断裂发生在同一个碱基对上则为同源性断裂，反之是异源性断裂，后者往往更频繁的发生。,14,15,DNA,双链中一条链断裂者称为单链断裂，(Single Strand Break,SSB),16,损伤识别,两条链在同一处或相邻处断裂者称为双链断裂，(Double Strand Break BSB),17,DNA链断裂,DNA断裂主要与羟自由基（HO,）的作用有关。,水在辐射分解后产生三种主要的自由基，即水合电子(G2.7)，羟自由基(G2.7)和氢自由基(G0.55)。,水合电子加合至碱基上，不能引起糖基上的磷酸二酯链断裂。氢自由基主要加至碱基上，只有一小部分能从糖基上抽氢。,羟自由基也主要(约80)加至碱基的双键上，但由于它的高反应性，能从糖基上抽去约20的氢。,18,DNA链断裂的主要特点,1.单链断裂与双链断裂的比值,DSB约为SSB的1/101/20,SSB由一个自由基攻击引起。,DSB必须由两个以上自由基引起。,一定能量的射线所产生的,SSB,和,DSB有一个大致的比值，但比值不是恒定的。,19,1.单链断裂与双链断裂的比值,如以DNA链断裂的G值表示，,噬菌体DNA在干燥状态下照射时，SSB的G值为0.71.1，而DSB的G值为0.060.16。,大鼠整体照射后分离肝细胞染色质，测得SSB的G值为1.52.0，DSB的G值为0.10。,有氧条件照射和无氧条件下照射相比，氧增强比约在25之间。,20,2.LET对链断裂的影响,各种射线对链断裂效应的顺序：,中子射线、紫外线,中子引起的DSB多于射线，而引起的SSB少于射线。,SSB,与,DSB,的比值与LET高低有关。,随着LET的升高，,SSB,减少，,DSB,增多。,21,3.氧效应对链断裂的影响,氧效应可增加链断裂的程度：,主要原因是,氧效应可增加羟自由基的产生。,22,4.DNA链发生的部位,剂量不同，DNA碱基发生断裂的概率亦不同。,当剂量20Gy照射时，碱基断裂顺序GATC。,当剂量 4080Gy照射时，碱基断裂顺序TGAC。,23,DNA自然断裂的发生,通常情况下,DNA,断裂的本底水平可达总,DNA,的百分之几。,一般方法难以测量，常引入凝胶模块的方法来解决。,24,碱基的损伤,在充氧情况下的照射，碱基的损伤主要是由于,羟自由基,(,OH)所致。,放射敏感性：,胸腺嘧啶,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,25,DNA交联（cross-linking）,DNA,交联分为三种形式：,a.,DNA,链间交联（,一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合,）,b.DNA,链内交联（,同一链上的两个碱基相互以共价键结合,）,c.,DNA-,蛋白质交联（,DNA,与蛋白质以共价键结合,）（,DNA protein cross-linking,，,DPC,）,26,DPC形成的分子机制,羟自由基（,OH）,是导致DPC形成的最有效的自由基，而水合电子和超氧化阴离子在DPC的形成中似乎无作用。,如果受照细胞的悬液中存在着羟自由基清除剂二甲基亚砜，则DPC生成量明显减少。,相反，如果将细胞置于含有N,2,O的气体中照射，因N,2,O能使水合电子转变为额外羟自由基，DPC产额大为提高。,27,氧效应对DPC形成的影响,氧效应对DPC形成有一定的影响。,有氧条件下进行紫外线照射,交联量增加,有氧条件下进行线照射,交联量减少；,反之去除游离氧之后产生的交联反应增强,。,28,温度对DPC形成的影响,增温能增加肿瘤细胞DPC的形成而用于放射治疗的增敏。,将中国仓鼠卵巢细胞置于45.5,保温17min，然后用x射线照射，可观察到与DNA交联的非组蛋白增加两倍。,如用增温处理HeLa细胞，DPC生成量随温度和保温时间直线上升。45保温30min，可使DPC增加1.57倍。,但也有报告指出，增温处理并不增加x射线引起的DPC，而是使DPC共价键的链型发生改变，处理后出现新的P-N键。,29,2.DNA-DNA链间的交联,在DNA的化学损伤中，DNA-DNA链间交联是最重要的一类。,在放射生物学中研究,DNA-DNA,链间的交联的报道较少。DNA链间交联与DNA链断裂相互竞争。,在干燥及含25%水的,DNA,中链间交联占优势；随着水分子的增加,DNA,链断裂生成率上升，而链间交联下降。,30,3.DNA链内交联-嘧啶二聚体的形成,二聚体的形成是指在辐射作用下，一个单链的2个相邻的碱基以共价键相连，两者之间形成一个环丁烷环。,二聚体的形成具有重要意义，因为它们在那一点上,阻断了DNA的复制,。,胸腺嘧啶二聚体（T-T）的形成最频繁而且又非常稳定，在受紫外线照射部位（脸、颈和手）引起皮肤癌的过程中，似乎起着重要作用。,二聚体形成是紫外线照射引起DNA的特征性改变。,电离辐射引起二聚体形成很少。,31,3.DNA链内交联-嘧啶二聚体的,形成,32,DNA损伤的生物学意义,众所周知，DNA是,细胞生长、发育、繁殖和遗传,的重要物质基础它蕴藏着丰富的遗传信息，通过转录和翻译，指导着蛋白质和酶的生物合成，主宰着细胞的各种生理功能。,33,DNA损伤的生物学意义,DNA,结构的完整与稳定在生物学上有着特别重要的意义。,在射线作用下，DNA碱基的损伤或脱落改变了密码，引起基因的,点突变,。,34,DNA损伤的生物学意义,转换：一个嘌呤被另一个嘌呤所取代或一个嘧啶被另一个嘧啶所取代,颠换：一个嘌呤被另一个嘧啶所取代或一个嘧啶被另一个嘌呤所取代,碱基缺失、移码突变、碱基插入,这样经转录和翻译后就会形成功能异常的蛋白质和酶，引起细胞突变或癌变。,35,DNA损伤的生物学意义,总之，DNA结构的辐射损伤在,细胞的致突，致癌机制,中起着重要作用，与细胞死亡反老化等过程亦有密切关系。,另外，细胞为了维护其生命和正常的机能活动，通过多种途径对各种类型的DNA损伤进行修复，决定细胞命运的不仅是损伤严重程度，其修复能力与修复机制亦十分重要。,36,DNA损伤的生物学意义,无错修复,有利于细胞恢复其正常机能而,易错修复,将导致基因突变。,DNA损伤和修复的规律在肿瘤治疗方面具有重要的应用价值。,例如、有选择地加重肿瘤细胞的DNA损伤，抑制其修复，以增强其放疗、化疗和热疗的效果。,37,电离辐射可造成DNA结构和功能损伤。由此而引起的一系列生物学后果不仅取决于,DNA的损伤程度,，而且还决定于其,修复能力,。,许多研究工作均证实了DNA辐射损伤后修复过程的存在。,早在1935年，Hollaender通过观察大肠杆菌在紫外线照射后的存活情况，首次提出了,修复,的概念。,DNA辐射损伤的修复,38,根据早期的研究工作，修复现象大体上可分为两种情况。,第一，将预定的照射剂量分次给予，生物效应则明显减轻。如用x射线分次照射中国仓鼠卵巢细胞，在4.87Gy照射后37,保温10h，再照5.05Gy，所得存活率明显高于9.92Gy单次照射。表明在两次照射间隔中细胞有所恢复。这种修复称作,亚致死损伤修复,。,DNA辐射损伤的修复,39,第二，在照射后改变细胞所处的状态和环境如延迟接种或给予不良的营养和环境条件，均能提高存活率。,例如，大肠杆菌B/r在x射线照射后维持在18,，小鼠淋巴白血病细胞L 5178Y在x射线照射后以34C处理，然后再以正常需要的温度培养，其存活率都比照后直接正常培养的明显提高。这种修复称作,潜在致死性损伤修复,。,DNA辐射损伤的修复,40,1964年Setlow和Carrier首次从,分子水平,揭示DNA的辐射损伤修复。,除了辐射损伤以外，许多物理和化学因子都能造成DNA损伤，并引起修复，即使在没有外来损伤的条件下，生物体内对自发损伤或复制错误也不断地进行修复。,DNA辐射损伤的修复,41,然而，在生物界所发现的能够在损伤后进行修复的生物分子为数很少。,除了氨基酰tRNA及细菌的肽聚糖外，,能进行修复的生物大分子只有DNA,。无疑这与DNA在生命过程中的重要功能是分不开的。,研究DNA修复将有助于深刻地理解生物在保存和传递遗传信息中维持稳定性的机制，了解突变与进化的分子过程。,DNA辐射损伤的修复,42,在放射生物学领域，对DNA修复的研究是一个重要的基础问题，理论上的阐明将有助于放射医学家和放射生物学家改进辐射损伤的防治，提高肿瘤的放疗效果，并且在探讨辐射致突与致癌机制方面有重要意义。,DNA辐射损伤的修复,43,DNA,损伤修复的不同类型,DNA,单链,断裂的修复,DNA,双链断裂的修复,碱基损伤的修复,DNA修复合成,44,DNA,的损伤修复机制,一种类型的DNA损伤可涉及多种修复途径，一种修复途径也可用于处理多种类型的DNA损伤。,在研究损伤修复机制时，多采用,紫外线损伤模型,，主要是由于紫外线造成的损伤类型比较单一，容易分析。,电离辐射损伤的修复在许多方面与之相似，但也有不同之处，应注意分辨。,45,DNA,的损伤修复机制,回复,修复,切除修复,excision repair,重组修复Recombination repair,SOS修复,错配修复Mismatch repair,46,DNA,单链断裂的修复,绝大多数正常细胞都能修复单链断裂。,例：用,射线照射中国仓鼠卵巢细胞，保温不同时间后测,DNA,单链断裂修复的程度。,47,48,DNA,单链断裂的修复,多数实验结果证明，DNA修复与时间呈指数关系，修复速度依赖于温度。,半修复期大致为1040min，因细胞类型和温度而异。,一般1h内DNA重接可达90%左右。,49,DNA双链断裂的修复,资料证明，哺乳动物细胞大多数都能进行此种修复，但,需要适宜的代谢条件和时间,。,有人报道中国仓鼠卵巢细胞和小鼠骨髓细胞受射线照射后的双链断裂修复。,用中性洗脱法显示，在射线100Gy照射后，保温30min，膜上DNA残存量均增加20%左右，说明双链断裂得到了部分修复。,50,细胞受,射线照射后保温30min膜上DNA残留率（%）,不照射,100Gy,100Gy后保温30min,CHO细胞,93.590.97,53.522.48,75.281.73,小鼠骨髓细胞,91.772.97,47.382.68,64.012.20,51,DNA双链断裂的修复,在研究双链断裂修复与细胞存活及染色体畸变的关系时，经过计算和推导，Chadwick等人得出结论：延迟接种能提高细胞存活率是与DNA双链断裂的修复有关。,也就是说，双链断裂的修复与潜在致死损伤的修复有直接的联系。而在重接时如果发生倒易重组，则导致染色体重排。细胞的突变频率也随之增加。,由此可见，照射后细胞中DNA双链断裂的修复是一个,关系到细胞最终转归,的极为重要的过程。,52,碱基损伤的修复,碱基的修复主要是紫外线引起的二聚体改变，受照射后经过保温，可以使二聚体减少，但,损伤碱基只是部分修复,。,53,DNA修复合成,细胞受紫外线、电离辐射和某些化学因子作用后，经过一段时间保温，可以观察到一种DNA合成。,这种合成不同于细胞增殖过程中的DNA复制，它的合成量相当低，合成起始于损伤后即刻，随时间延长而增加，但与细胞周期没有关系，经研究分析，确定这是一种修复合成，称之为,DNA期外合成或程序外DNA合成,。,54,回复修复,定义：,回复修复是细胞对DNA的某些损伤修复的一种,简单方式,，在单一基因产物的催化下，一步反应就可以完成。,其机制包括酶学光复活修复、单链断裂的重接和嘌呤的直接插入。,55,回复修复,酶学光复活修复,是修复DNA链上的嘧啶二聚体的一种最直接方式，也是,最早发现,的DNA修复方式。,在上世纪40年代末就已报道，50年代末发现此过程是一个酶学催化过程，因为,需要光的作用,而得名为酶学光复活。,催化此反应的酶称为光复活酶（photoreactivating enzyme）或DNA光解酶。,56,57,回复修复,该酶的作用过程分为三个步骤：,酶与DNA中的二聚体部位相结合；,吸收波长为260380nm的近紫外光将酶激活，使二聚体解聚；,酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。,酶学光复活修复,主要是,低等生物修复紫外线损伤,的一种方式。对于高等生物细胞及人的组织细胞不是主要途径。,58,回复修复,DNA单链断裂中有一部分是通过简单的重接而修复的，只需要,DNA连接酶,（ligase）参加。也属于直接回复。,此酶在各类生物的各种细胞中普遍存在，修复反应容易进行。,DNA链上的嘌呤碱基受到辐射损伤时，修复此类损伤需要特异性酶，即,DNA嘌呤插入酶,（insertase）。,59,回复修复,上述几种直接回复是修复最直接的方式，对细胞非常有利。,因为修复所需要的酶比较单一，而且只有一步反应，修复特异性高，较少发生错误。,但实际上，这种修复的例子,比较局限,。,60,切除修复,切除修复：将损伤区域切除，然后用正确配对的完好的碱基来替代，是,最普遍的方式。,基本步骤：识别切除修补再连接。,三个特点:准确、无误、正确修复。,61,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA,聚合酶I,DNA连接,酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,62,切除修复,识别：细胞内存在一系列能识别受损伤碱基的酶和蛋白质，有的只有识别能力，有,的同时具有识别能力和切除能力。,切除：,碱基切除和核苷酸切除。前者只切除,异常的碱基,，,后者被切除的不是单个的游离碱基，而是,一段寡核苷酸,，是细胞内最为普遍的修复方式。,63,切除修复,修补：DNA链中的损伤区域经上述酶和蛋白切除后，留下一个或一大段空缺，需要,DNA聚合酶,来修补。,连接：修补过程可以将空隙中的核苷酸全部补齐。完成最后一个磷酸二酯键的连接需要依靠,DNA连接酶,。,64,重组修复,当,DNA,双链发生严重损伤时需要另一种机理完成正确的修复。,一种情况是,两条链同时受到损伤,；另一种是,单链损伤尚未修复发生了复制,，造成对应于损伤位置的新链缺乏正确模板，此时需要重组酶系将另一段未受损伤的双链DNA移到损伤位置附近，提供正确的模板，进行重组。,DNA,复制重组再合成,65,二聚体,66,recA蛋白,缺口,67,杂合双链,杂合双链,68,切割,69,重组修复,遗传信息有缺损的子代DNA分子通过遗传重组的方式加以弥补，即从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。,70,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,71,重组修复,通过这种机制实现了DNA复制，而且复制合成的新链上不存在损伤。,由于修复发生在复制之后，故多为,复制后修复,。因修复机制是通过重组，故称之为重组修复。,需要指出的是，这种修复机制,只修复复制后的新链,，而母链上原有的损伤依然存在，还需通过其它机制进行清除。,72,重组修复,重组修复并没有从亲代DNA中去除二聚体，当第二次复制时，留在母链中的二聚体仍使复制不能正常进行，复制经过损伤部位时所产生的切口，仍旧要用同样的重组过程来进行，但随着DNA复制的继续，损伤的DNA链逐渐“稀释”，最后不再影响正常生理功能。,73,SOS修复,大肠杆菌中还存在一种修复机制，在正常生理状态下处于抑制状态。,一旦DNA受到损伤，产生一种调控信号，解除对许多基因的抑制，使这些基因的产物投入活跃的修复活动，从而提高细菌存活。,74,SOS修复,这是细胞处于危急状态下发生的一种修复，1973年Radman首次用一个国际通用的紧急呼救信号“SOS”形象地描述此种修复现象，故称之为,SOS修复,。,细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。,SOS修复过程是在损伤信号诱导下发生的，又称为,可诱导的DNA修复,，修复过程中容易发生错误，亦称为,易错修复,。,75,错配修复,原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于,5GATC,序列中,腺苷酸的N6位甲基化,。,复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列，并以甲基化的链为模板进行修复。,76,错配修复,在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。,修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。,77,错配修复,错配修复是生物维持生命、保持物种稳定的一种重要功能，从细菌到哺乳动物普遍具有这种修复机制。,78,