酶(Enzyme)省名师优质课获奖课件市赛课一等奖课件.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,第二章酶(,Enzyme,),第1页,1.酶概念,酶,是一类由活性细胞产生含有催化作用和高度专一性特殊,蛋白质,。简单说，酶是一类由活性细胞产生,生物催化剂,。,一、酶概念,第2页,2.酶催化作用特点,(1)酶和普通催化剂,共性,：,加紧反应速度；,不改变平衡常数；,本身不参加反应。,(2)酶催化作用,特征,：,条件温和,：常温、常压、pH=7；,高效率,：反应速度与不加催化剂相比可提升10,8,10,20,，与加普通催化剂相比可提升10,7,10,13,；,专一性,：即酶只能对特定一个或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白立体结构所决定。可分为：,绝对专一性：有些酶只作用于一个底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。,相对专一性：这类酶对结构相近一类底物都有作用。包含键专一性和簇（基团）专一性。,立体异构专一性：这类酶不能区分底物不一样立体异构体，只对其中某一个构型起作用，而不催化其它异构体。包含旋光异构专一性和几何异构专一性。,易变敏感性,：易受各种原因影响，在活细胞内受到精密严格调整控制。,第3页,二、酶化学本质及结构功效特点,1.,发展史,(1)酶是蛋白质:,1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质观念，其含有蛋白质一切性质。,(2)核酶发觉：,19811982年，Thomas R.Cech试验发觉有催化活性天然RNARibozyme。,L19 RNA和核糖核酸酶PRNA组分含有酶活性是两个最著名例子。,1955年，发觉DNA催化活性。,(3)抗体酶（abzyme）：,1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz利用单克隆抗体技术制备了含有酶活性抗体（catalytic antibody）。,第4页,酶,单成份酶,：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。,双成份酶,酶蛋白,辅因子,（,简单蛋白质,）,（结合蛋白质）,（apoenzyme）,（cofacter),辅酶,（coenzyme),辅基,(prosthetic group),全酶,(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子,2.酶组成,第5页,3.酶辅因子,酶辅因子是酶对热稳定非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或一些基团载体参加反应并促进整个催化过程。,(1)传递电子体：,如,卟啉铁,、,铁硫簇,；,(2)传递氢（递氢体）：,如,FMN/FAD、NAD/NADP,、,C,0,Q,、,硫辛酸,；,(3)传递酰基体：,如,C,0,A、TPP、,硫辛酸,；,(4)传递一碳基团：,如,四氢叶酸,；,(5)传递磷酸基：,如,ATP，GTP,；,(6)其它作用：,转氨基，如,V,B6,；,传递CO,2,，如,生物素,。,第6页,维生素和辅酶,维生素是机体维持正常生命活动所,必不可少,一类小分子有机物质。,多数维生素维生素作为辅酶和辅基组成成份，参加体内物质代谢。,维生素普通习惯分为,脂溶性,和,水溶性,两大类。其中脂溶性维生素在体内可直接参加代谢调整作用，而水溶性维生素是经过转变成辅酶对代谢起调整作用。,一些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为,辅酶（或辅基）,。,辅酶是一类含有特殊化学结构和功效化合物。参加酶促反应主要为,氧化-还原反应或基团转移反应,。,大多数辅酶,前体,主要是水溶性 B 族维生素。许多维生素生理功效与辅酶作用亲密相关。,第7页,脂溶性维生素,维生素A,D,E,K均溶于脂类溶剂，不溶于水，在食物中通常与脂肪一起存在，吸收它们，需要脂肪和胆汁酸。,维生素A,维生素A分A1,A2两种，是不饱和一元醇类。维生素A1又称为视黄醇，A2称为脱氢视黄醇。,主要功效：维持上皮组织健康及正常视觉，促进年幼动物正常生长。,第8页,维生素D,维生素D是固醇类化合物，主要有D2,D3,D4,D5。其中D2,D3活性最高。,第9页,维生素D结构,在生物体内，D2和D3本身不含有生物活性。它们在肝脏和肾脏中进行羟化后，形成1，25-二羟基维生素D。其中1，25-二羟基维生素D3是生物活性最强。,主要功效：调整钙、磷代谢，维持血液中钙、磷浓度正常，促使骨骼正常发育。,第10页,维生素E,维生素E又叫做生育酚，当前发觉有6种，其中,，四种有生理活性。,主要功效：含有抗氧化剂功效，可作为食品添加剂使用，还可保护细胞膜完整性；同时还有抗不育作用。,第11页,维生素K,维生素K有3种：K1,K2,K3。其中K3是人工合成。维生素K是2-甲基萘醌衍生物。,主要功效：促进肝脏合成凝血酶原，促进血液凝固。,第12页,水溶性维生素,维生素,B,1,和羧化辅酶,维生素,B,1,又称硫胺素，在体内,以焦磷酸硫胺素(TPP)形式存在。缺乏时表现出多发性神经炎、皮肤麻木、心力衰竭、四肢无力、下肢水肿,。,第13页,焦磷酸硫胺素(TPP)是脱羧酶辅酶，催化丙酮酸或,酮戊二酸氧化脱羧反应，所以又称为羧化辅酶。,第14页,维生素,B,2,和黄素辅酶,维生素B,2,又称核黄素，由核糖醇和6，7-二甲基异咯嗪两部分组成。,缺乏时组织呼吸减弱，代谢强度降低。主要症状为口腔发炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。,第15页,FAD(黄素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)衍生物。它们在脱氢酶催化氧化-还原反应中，起着电子和质子传递体作用。,第16页,泛酸和辅酶,A（CoA）,维生素B3又称泛酸，是由,-二羟基-二甲基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成,。,第17页,辅酶A是生物体内代谢反应中乙酰化酶辅酶，它是含泛酸复合核苷酸。它主要生理功效是传递酰基，是形成代谢中间产物主要辅酶。,第18页,维生素PP和辅酶I、辅酶II,维生素PP包含尼克酸（又称烟酸）和尼克酰胺（又称烟酰胺）两种物质。在体内主要以尼克酰胺形式存在，尼克酸是尼克酰胺前体。,尼克酸,尼克酰胺,第19页,维生素PP能维持神经组织健康。缺乏时表现出神经营养障碍，出现皮炎。,NAD,+,(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I)和NADP,+,(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II)是维生素烟酰胺衍生物，它们是各种主要脱氢酶辅酶。,第20页,维生素B,6,和磷酸吡哆醛,维生素B,6,包含吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。,维生素B,6,在体内经磷酸化作用转化为对应磷酸脂，参加代谢主要是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。磷酸吡哆醛是氨基酸转氨作用、脱羧作用和消旋作用辅酶。,第21页,生物素,生物素是,B,族维生素,B,7,，它是各种羧化酶辅酶。,生物素功效是作为,CO,2,递体，在生物合成中起传递和固定,CO,2,作用。,第22页,叶酸和叶酸辅酶,维生素,B,11,又称叶酸，作为辅酶是叶酸加氢还原产物四氢叶酸。,四氢叶酸主要作用是作为一碳基团，如,-CH,3,-CH,2,-,-CHO,等载体，参加各种生物合成过程。,第23页,维生素B,12,和B,12,辅酶,维生素B,12,又称为钴胺素。维生素B,12,分子中与Co,+,相连CN基被5-脱氧腺苷所取代，形成维生素B,12,辅酶。,维生素B,12,辅酶主要功效是作为变位酶辅酶，催化底物分子内基团(主要为甲基)变位反应。,第24页,第25页,维生素C,维生素C能防治坏血病，故又称抗坏血酸。,在体内参加氧化还原反应，羟化反应。人体不能合成。,第26页,硫辛酸,硫辛酸是少数不属于维生素辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式：即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）。,第27页,辅酶Q（CoQ）,辅酶Q又称为泛醌，广泛存在与动物和细菌线粒体中。,辅酶Q活性部分是它醌环结构，主要功效是作为线粒体呼吸链氧化-还原酶辅酶，在酶与底物分子之间传递电子。,第28页,4.酶结构与功效特点,蛋白质结构特点：,一级、二级、三级、四级结构,依据结构不一样酶可分为：,单体酶,：只有单一三级结构蛋白质组成。,寡聚酶,：由多个（两个以上）含有三级结构亚基聚合而成。,多酶复合体,：由几个功效相关酶嵌合而成复合体。,第29页,与催化作用相关结构特点,(1)活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应空间局限（部位）。,结合部位,(Binding site)：酶分子中与底物结合部位或区域普通称为结合部位,。,第30页,第31页,催化部位,(,Catalytic site,):酶分子中促使底物发生化学改变部位称为催化部位。,通常将酶结合部位和催化部位总称为酶活性部位或活性中心。,结合部位决定酶专一性，,催化部位决定酶所催化反应性质。,第32页,第33页,调控部位,(Regulatory site):酶分子中存在着一些能够与其它分子发生某种程度结合部位，从而引发酶分子空间构象改变，对酶起激活或抑制作用,第34页,(2)必须,基团：酶表现催化活性不可缺乏基团。,亲核性基团：丝氨酸羟基，半胱氨酸巯基和组氨酸咪唑基。,酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸羧基，赖氨酸氨基，酪氨酸酚羟基，组氨酸咪唑基和半胱氨酸巯基等。,亲核性基团,酸碱性基团,第35页,(,3)酶原和酶原激活：,酶原,：没有活性酶前体。,酶原激活,：酶原在一定条件下经适当物质作用可转变成有活性酶。酶原转变成酶过程称为酶原激活。,本质,：酶原激活实质上是酶活性部位形成或暴露过程。,(4)同功酶：能催化同一化学反应一类酶。,活性中心相同或相同：催化同一化学反应。,分子结构不一样：理化性质和免疫学性质不一样。,第36页,三、酶分类及命名,1.酶分类,氧化-还原酶 Oxidoreductase,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。,主要包含脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。,如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸脱氢反应。,第37页,(2),转移酶 Transferase,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子基团或原子转移到另一个底物分子上。比如，谷丙转氨酶催化氨基转移反应。,第38页,水解酶 Hydrolase,水解酶催化底物加水分解反应。,主要包含淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。,比如，脂肪酶(Lipase)催化脂水解反应,第39页,(4),裂解酶 Lyase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或 原子形成双键反应及其逆反应。,主要包含醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。,比如，延胡索酸水合酶催化反应。,第40页,(5),异构酶 Isomerase,异构酶催化各种同分异构体相互转化，即底物分子内基团或原子重排过程。比如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化反应。,第41页,(6),合成酶 Ligase or Synthetase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。,A+B+ATP+H-O-H=A,B+ADP+Pi,比如，丙酮酸羧化酶催化反应,丙酮酸 +,CO2,草酰乙酸,第42页,核酸酶（催化核酸）Ribozyme,核酸酶是唯一非蛋白酶。它是一类特殊RNA，能够催化RNA分子中磷酸酯键水解及其逆反应。,第43页,2.酶命名,(1)习惯命名法:,依据其催化底物来命名；,依据所催化反应性质来命名；,结合上述两个标准来命名；,有时在这些命名基础上加上酶起源或其它特点。,第44页,(2),国际系统命名法,系统名称包含底物名称、构型、反应性质，最终加一个酶字。比如：,习惯名称:谷丙转氨酶,系统名称:丙氨酸：,-酮戊二酸氨基转移酶,酶催化反应:,谷氨酸+丙酮酸,-酮戊二酸+丙氨酸,第45页,1.酶催化作用,本质,：降低反应活化能,2.酶催化作用,中间产（络合）物学说,在酶催化反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学改变后，中间复合物再分解成产物和酶。,E +S =E-S,P +E,许多试验事实证实了ES复合物存在。ES复合物形成速率与酶和底物性质相关。,四、酶作用机制,第46页,3.酶与底物结合形成中间络合物方式（理论）,(1)锁钥假说(lock and key hypothesis)：,认为整个酶分子天然构象是含有刚性结构，酶表面含有特定形状。酶与底物结合如同一把钥匙对一把锁一样,(2)诱导契合假说（inducedfit hypothesis):,该学说认为酶表面并没有一个与底物互补固定形状，而只是因为底物诱导才形成了互补形状.,第47页,4.使酶含有高效催化原因,(1)临近定向效应：,在酶促反应中，底物分子结合到酶活性中心，首先底物在酶活性中心有效浓度大大增加，有利于提升反应速度；,另首先，因为活性中心立体结构和相关基团诱导和定向作用，使底物分子中参加反应基团相互靠近，并被严格定向定位，使酶促反应含有高效率和专一性特点。,(2),“张力”和“形变”：,底物与酶结合诱导酶分子构象改变，改变酶分子又使底物分子敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶,底物中间产物进入过渡态。,第48页,(,3)酸碱催化：,酸-碱催化可分为狭义酸-碱催化和广义酸-碱催化。酶参加酸-碱催化反应普通都是广义酸碱催化方式。,广义酸碱催化是指经过质子酸提供部分质子,或是经过质子碱接收部分质子作用，到达降低反应活化能过程。,酶活性部位上一些基团能够作为良好质子供体或受体对底物进行酸碱催化。,His,残基咪唑基是酶酸碱催化作用中最活泼一个催化功效团。,广义酸基团 广义碱基团,（质子供体）（质子受体,）,第49页,(4)共价催化：,催化剂经过与底物形成反应活性很高共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提升反应速度过程，称为共价催化。,酶中参加共价催化基团主要包含 His 咪唑基，Cys 硫基，Asp 羧基，Ser 羟基等。,一些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也能够参加共价催化作用。,第50页,1.,底物浓度,对酶促反应速度影响,在酶浓度，pH，温度等条件不变情况下研究底物浓度和反应速度关系。如右图所表示：,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为,一级反应特征,。,当底物浓度到达一定值，几乎全部酶都与底物结合后，反应速度到达最大值（,V,max），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为,零级反应,。,五、酶促反应速度及其影响原因,第51页,米氏方程,1913年，德国化学家Michaelis和Menten依据,中间产物学说,对酶促反应动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系著名公式，称为,米氏方程,。,K,m,米氏常数,V,max,最大反应速度,第52页,依据中间产物学说，酶促反应分两步进行:,米氏方程推导：,第53页,第54页,米氏常数,Km,意义:,由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度二分之一时,即,V,=1/2,V,max,K,m=S,上式表示,米氏常数是,反应速度为最大值二分之一时底物浓度,。,所以,米氏常数单位为mol/L。,不一样酶含有不一样Km值，它是酶一个主要特征物理常数。,Km,值只是在固定底物，一定温度和pH条件下，一定缓冲体系中测定，不一样条件下含有不一样Km值。,Km值表示酶与底物之间,亲和程度,：Km值大表示亲和程度小，酶催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶催化活性高。,第55页,测定Km和V方法很多，最惯用是Lineweaver,Burk作图法,双倒数作图法,。,1,K,m 1 1,=,+,V,V,max S,V,max,取米氏方程式倒数形式：,1/,Vmax,斜率=,Km/Vmax,-1/,Km,米氏常数Km,测定：,第56页,2.,抑制剂,对酶反应影响,有些物质能与酶分子上一些必须基团结合（作用,),使酶活性中心化学性质发生改变，造成酶活力下降或丧失，这种现象称为,酶抑制作用,。,能够引发酶抑制作用化合物则称为,抑制剂,（inhibitor)。,酶抑制剂普通具备两个方面,特点,：,a.在化学结构上与被抑制底物分子或底物过渡状态相同。,b.能够与酶活性中心以非共价或共价方式形成比较稳定复合体或结合物。,第57页,抑制作用类型：,(1)不可逆抑制作用,：,抑制剂与酶反应中心活性基团以共价形式结合，引发酶永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,第58页,(2)可逆抑制作用,：,抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引发酶活性暂时性丧失。抑制剂能够经过透析等方法被除去，而且能部分或全部恢复酶活性。,根椐抑制剂与酶结合情况，又能够分为三类：,竞争性抑制：,一些抑制剂化学结构与底物相同，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。,竟争性抑制通常能够经过增大底物浓度，即提升底物竞争能力来消除。,竞争性抑制可用下式表示：,第59页,第60页,第61页,第62页,有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+I/Ki)倍，且Km值随I增高而增大；,在E固定时，当S Km(1+I/Ki),Km(1+I/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。,竞争性抑制作用速度方程：,第63页,竞争性抑制作用Lineweaver,Burk图：,第64页,非竞争性抑制：,酶可同时与底物及抑制剂结合，引发酶分子构象改变，并导至酶活性下降。因为这类物质并不是与底物竞争与活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。,如一些金属离子（Cu,2+,、Ag,+,、Hg,2+,）以及EDTA等，通常能与酶分子调控部位中-SH基团作用，改变酶空间构象，引发非竞争性抑制。,非竟争性抑制不能经过增大底物浓度方法来消除,。,非竞争性抑制可用下式表示：,第65页,第66页,有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+I/Ki)倍，且V值随I增高而降低；,Km值不变。,非竞争性抑制作用速度方程：,第67页,非竞争性抑制作用Lineweaver,Burk图：,第68页,有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+I/Ki)倍，且都随I增高而降低,。,反竞争性抑制,：,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引发酶活性下降。,反竞争性抑制可用下式表示：,反竞争性抑制作用速度方程：,第69页,反竞争性抑制作用Lineweaver,Burk图：,第70页,3.,激活剂,对酶反应影响,凡是能提升酶活力简单化合物都称为,激活剂,（activator)。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。,如：Na,+,、K,+,、Ca2,+,、Mg,2+,、Cu,2+,、Zn,2+,、Co,2+,、Cr,2+,、Fe,2+,、Cl,-,、Br,-,、I,-,、CN,-,、NO,3,-,、PO,4,-,等；,这些离子可与酶分子上氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位组成部分，也可能作为辅酶或辅基一个组成部分起作用；,普通情况下，一个激活剂对某种酶是激活剂，而对另一个酶则起抑制作用；,对于同一个酶，不一样激活剂浓度会产生不一样作用。,4.,酶浓度,对酶反应影响,在底物足够过量而其它条件固定情况下，而且反应系统中不含有抑制酶活性物质及其它不利于酶发挥作用原因时，酶促反应速度和酶浓度成正比。,第71页,5.,温度,对酶反应影响,首先是温度升高,酶促反应速度加紧。,另首先,温度升高,酶高级结构将发生改变或变性，造成酶活性降低甚至丧失。,所以大多数酶都有一个,最适温度,。在最适温度条件下,反应速度最大。,最适温度,第72页,6.,pH,对酶反应影响,在一定pH下,酶含有最大催化活性,通常称此pH为,最适pH,。,第73页,第74页,7.酶别构（变构）效应：,因为效应物存在，而引发酶,结构（构象）,改变。,别构酶(Allosteric enzyme),特点,：,普通是,寡聚酶,，由多亚基组成，包含催化部位和调整（别构）部位；,含有,别构效应,。指酶和一个配体（底物，调整物）结合后能够影响酶和另一个配体（底物）结合能力。,相同（均为底物）：同促效应（,homotropic effect,）,不一样（效应调整物）：异促效应,（heterotropic effect）,依据配体结合后对后继配体影响,依据配体性质,正协同效应,（positive cooperative effect）,负协同效应,（negative cooperative effect）,动力学特点,：不符合米曼方程双曲线。,第75页,别构酶与非调整酶动力学曲线比较,第76页,别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase,第77页,8.固定化酶,固定化酶,是经过吸附、耦联、交联和包埋等物理或化学方法把酶连接到某种载体上，做成仍含有酶催化活性水不溶性酶。,作用特点,：稳定性提升，易分离，可重复使用，提升操作机械强度。,第78页,六、酶分离纯化与酶活力测定,1.酶分离纯化,基本标准,：提取过程中防止酶变性而失去活性；预防强酸、强碱、高温和猛烈搅拌等；要求在低温下操作，加入化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.,基本操作程序：,选材,：微生物（微生物发酵物:胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。,抽提,：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，重复冻融或自溶等），,分离,：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采取沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。,纯化,：可采取离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。,第79页,酶制剂形式：,固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）,液体,保留：低温下短期保留。,2.酶活力测定,概念,酶活力,：又称为酶活性，普通把酶催化一定化学反应能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化化学反应速度来表示。,基本原理,:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，普通对酶测定，不是直接测定其酶蛋白浓度，而是测定其催化化学反应能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应初始阶段，酶促反应速度（初速度）与酶浓度成正比（即V=KE），故酶活力测定是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。,第80页,酶活力测定,酶活力测定就是测定一定量酶，在单位时间内产物(P)生成（增加）量或底物（S）消耗（降低）量。即测定时确定三种量：,加入一定量酶；一定时间间隔；物质增减量,。,测定酶活力常有以下几个方法：,在一个反应体系中，加入一定量酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生化学反应量（终止时与起始时浓度差），这时测得是,初速度,。,在一定条件下，加入一定量底物（要求），再加入适当量酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需时间，（,非初速度,，为一平均速度）。,动态连续测定法,。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物消耗或产物生成。,快速反应追踪法,。近年来，追踪极短时间（10,-3,s以下）内反应过程方法和装置已经应用。其代表有,停流法（stopped-flow）和温度跃变法（temperature jump）。,酶反应条件优化：,测酶活所用反应条件应该是,最适条件,，所谓最适条件包含最适温度、最适pH、足够大底物浓度、适宜离子强度、适当稀释酶液及严格反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。,第81页,酶活力测定方法：,反应计时,。反应计时必须准确。反应体系必须预热至要求温度后，加入酶液并马上计时。反应到时，要马上灭酶活性，终止反应，并统计终了时间。终止酶反应，常使酶立刻变性，最惯用方法是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用,SDS,使酶变性，或快速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停顿反应或用破坏其辅因子来停顿反应。,反应量测定,。测底物降低许或产物生成量均可。在反应过程中产物是从无到有，改变量显著，极利于测定，所以大都测定产物生成量。,详细物质量测定，据被测定物质物理化学性质经过定量分析法测定。惯用方法有：,光谱分析法,：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用,分光光度法或荧光光度法,测出化合物。,化学法,：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出化合物，然后再反过来算出酶活性。,放射性化学法,：用同位素标识底物，经酶作用后生成含放射性产物，在一定时间内，生成放射性产物量与酶活性成正比。,第82页,3.酶活力表示方法及计算,酶活力单位,酶活力可用单位时间内单位体积中底物降低许或产物增加量表示，单位为mol/min等。,酶活力单位基本定义,为：要求条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需酶量。,据不一样情况有几个酶活力单位（activity unit）或又称,酶单位,（enzyme unit）。,国际单位,：,普通用活力单位U（Unit）,表示，许多酶活力单位都是以最正确条件或某一固定条件下每分钟催化生成1,mol,产物所需要酶量为一个酶活力单位。,第83页,一个“Katal”单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需酶量。,Kat和U换算关系：1 Kat=610,7,U，1U=16067,n,Kat,以上酶单位定义中，假如底物（S）有一个以上可被作用化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol相关基团转化酶量。假如是两个相同分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化酶量称为一个酶单位。,在“U”和“kat”酶活力单位定义和应用中，酶催化底物分子量必须是已知，不然将无法计算,。,习惯单位,：,在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观，要求酶活力单位，不一样酶有各自要求，如：,-淀粉酶活力单位,：每小时分解1g可溶性淀粉酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有要求每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。,糖化酶活力单位,：在要求条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需酶量为一个酶单位。,蛋白酶,：要求条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需酶量。,DNA限制性内切酶,：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1g纯化DNA所需酶量。,第84页,比活力,（specific activity）,酶比活力是每单位（普通是mg）蛋白质中酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白），实际应用中也用每单位制剂中含有酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂），对同一个酶来讲，比活力愈高则表示酶纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低一个指标。,在评价纯化酶纯化操作中，还有一个概念就是回收率。,回收率,=某纯化操作后总活力/某纯化操作前总活力,总活力=比活力总体积（总重量）,酶活力计算及计算举例,酶活力计算是将试验中所用各种参数和所测得试验数据（反应时间、酶液稀释度和用量、产物生成量等）换算成每毫升（或每克）酶制剂中所含酶活力单位数。,酶活力测定举例：,福林-酚（Lowry）法,测定蛋白酶活力。该方法基本原理是以酪蛋白为底物进行反应，然后用福林-酚试剂显色，并用光度法测定酶促反应产物酪氨酸生成量。测定在初速度阶段进行，为初速度法。,第85页,本章小结,一、酶,酶概念,酶催化作用特点,共性,特征,：条件温和、高效率、专一性、易变敏感性,二、酶化学本质及结构功效特点,酶：单纯酶,结合酶：,全酶=酶蛋白+辅因子,酶辅因子,维生素和辅酶,维生素是机体维持正常生命活动所必不可少一类小分子有机物质。,维生素普通习惯分为脂溶性和水溶性两大类。,辅酶是一类含有特殊化学结构和功效化合物。参加酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。,大多数辅酶前体主要是水溶性 B 族维生素。许多维生素生理功效与辅酶作用亲密相关。,第86页,酶结构与功效特点,(1),活性中心,：,结合部位、催化部位、调控部位,(2),必须基团,(3)酶原和酶原激活,(4)同功酶,三、酶分类及命名,四、酶作用机制,1.酶催化作用,本质,：降低反应活化能,2.酶催化作用,中间产（络合）物学说,E +S =E-S,P +E,3.酶与底物结合形成中间络合物方式：,锁钥假说、诱导契合假说,4.使酶含有高效催化原因,临近定向效应,“张力”和“形变”,酸碱催化,共价催化,第87页,五、酶促反应速度及其影响原因,1.底物浓度对酶促反应速度影响,米氏方程,米氏常数Km,意义,:米氏常数是反应速度为最大值二分之一时底物浓度。米氏常数单位为mol/L。,Km值表示酶与底物之间亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶催化活性高。,第88页,2.抑制剂对酶反应影响,抑制作用类型：,不可逆抑制作用,可逆抑制作用,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,a,b,c,第89页,3.激活剂对酶反应影响：提升酶活力,4.酶浓度对酶反应影响:在一定条件下酶促反应速度和酶浓度成正比。,5.温度对酶反应影响:最适温度,6.pH对酶反应影响：最适pH,7.酶别构（变构）效应,别构酶特点：,普通是寡聚酶,含有别构效应,反应速度和底物浓度关系不,符合米曼方程双曲线,8.固定化酶,六、酶分离纯化与酶活力测定,1.酶分离纯化,基本标准：提取过程中防止酶变性而失去活性,基本操作程序：,选材,抽提,分离,纯化,酶制剂形式与保留,第90页,2.酶活力测定,概念,酶活力,：又称为酶活性，普通把酶催化一定化学反应能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化化学反应速度来表示。,酶活力测定就是测定一定量酶，在单位时间内产物(P)生成（增加）量或底物（S）消耗（降低）量。即测定时确定,三种量,：加入一定量酶；一定时间间隔；物质增减量。,测定酶活力常有以下几个方法,初速度法,平均速度法,动态连续测定法,快速反应追踪法,测酶活所用反应条件应该是最适条件,第91页,酶活力测定方法：,反应计时,反应量测定,：依据被测定物质物理化学性质经过定量 分析法测定。惯用方法有：光谱分析法、化学法和放射性化学法。,3.酶活力表示方法及计算,酶活力单位基本定义为：要求条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需酶量。,国际单位：,“,U,”,和,“,Kat,”,习惯单位,比活力：酶比活力是每单位（普通是mg）蛋白质中酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白）。,回收率=某纯化操作后总活力/某纯化操作前总活力,第92页,