靶向PCRCTC检测技术帮助临床医生更全面地评估肺癌.pptx
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1、靶向PCR CTC检测技术帮助临床医生更全面地评估肺癌 Lung Cancer in Solid Tumor in China=?液态活检液态活检通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤病理活检病理活检通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤 CTC ctDNA mircoRNA LNC RNAOthers 传统的组织细胞学检测液态活检在肺癌中的应用液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发治疗策略事件疑似肺癌辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择耐药机理新药研发CTC的临床应用价值疗效评估CTC(数量)(
2、负向富集+靶向PCR)ctDNA(基因变异)1、K.Pantel,et al.Nat Rev Clin Oncol,2009;2、K.Pantel and MR.Speicher,Oncogene 2015什么是循环肿瘤细胞(什么是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell,CTCCTC)?肿瘤释放如外周血中肿瘤释放如外周血中CTCsCTCs数量的多少,数量的多少,可间接反应肿瘤发生发展的功能状态可间接反应肿瘤发生发展的功能状态CTCCTC:在肿瘤发生过程中,具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞,均由原发肿瘤脱落释放入
3、外周血,两者统称循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell)CTC1CTCCTC有转移有转移:侵入第二器官CTCs,称之为DTC(disseminated Tumor Cell),只有由具有干细胞特征干细胞特征的DTC所形形成的微转移灶成的微转移灶,逃避免疫识别逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2第9周的乳腺管组织切片:乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片:新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质CK+cellsHER-2+cells什么时候可以检测到CTC?早期肿瘤外周血中即可检出CTCW He,et al.Proc Natl Acad Sci,2007早期肿瘤外
4、周血中即可检出CTCl表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面l移植2周后,在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞l移植后第3和第4周,则每分钟可分别检测7个和18个CTC,随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升l在肿瘤移植的前4周内,没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象CTC富集技术密度与大小免疫磁珠(负向富集 or 阳性富集)微流体CTC检测方法CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR=+“方法”“收获”“垃圾”蟹饵没水了,我们躲不了了放水负向富集负向富集优势:回收率100%劣势:纯度略低正向富集正向富集优势:纯度高劣势:
5、回收率低(漏掉CTC)幸好没贪嘴,我们逃了“方法”“收获”“垃圾”没水了,我们躲不了了放水负向富集负向富集优势:回收率100%劣势:纯度略低大小富集(大小富集(ISETISET)优势:简单劣势:漏掉小的CTC细胞幸好没吃胖,我们逃了网筛CytoploRare(FR靶向PCR CTC检测技术)检测原理负向富集负向富集靶向靶向PCRPCRFRFR阳性靶标阳性靶标肺癌细胞FR(叶酸受体)高度表达CTC:FR=1:50万EMT转化不影响FR丰度其他血细胞不表达FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自动化灵敏度超高灵敏度超高,负向富集可满足检测要求信号二次放大,1个CTC信号放大1012倍无需人工
6、经验判读,结果客观准确可实现CTC的定量CytoploRare FR靶向PCR CTC检测靶向PCR,信号放大,保证高度敏感性1个CTC信号放大1012倍优势一:阴性富集不丢失循环肿瘤细胞优势二:靶向探针特异性高优势三:PCR扩增信号,确保高敏感性优势四:PCR仪判断CTC技术,避免人为误差CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性3mL血1mL/3mL血3mL血1个CTC/3mL血50万FR/1个CTC1个CTC/1slide100万信号/1个FR1个信号/1个CTCFR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法1
7、012101210121012倍(万亿倍)倍(万亿倍)倍(万亿倍)倍(万亿倍)细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大CytoploRare FR靶向PCR CTC检测敏感性试验:1ctc in 1,200,000白细胞Jiatao Lou,et al.Plos One 2013l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107)l FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%,且呈线性分布l检测灵敏度约为5.09/(1.23*107)=1/240万600万掺入细胞数量掺入细胞数量(个个)检出细胞数量检出细胞数量(CU)(CU)复管复管1 1复管复管2 2复管
8、复管3 3检测均值检测均值检出细胞数检出细胞数(个个)回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R600571.52 565.13 586.37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9998400372.13 372.99 379.75 374.96 379.59 94.90 200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 10093.66 96.73 90.08 93.49 90.84 90.84 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 2020.43 24.58 23.87 2
9、2.96 18.48 92.40 1017.48 17.16 14.56 16.40 11.75 117.51 59.90 9.26 10.58 9.91 5.09 101.87 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00/l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107)l 检测灵敏度约为5.09/(1.23*107)=1/240万600万CytoploRare FR靶向PCR CTC检测敏感性试验:1ctc in 6,000,000白细胞CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术F
10、R(叶酸受体,高度特异性的靶向探针)l 特异性高:特异性高:加入FR靶向探针前,加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体,检测结果为阴性l 背景表达:背景表达:去除FR靶向探针,仅保留特异性DNA片段,与保留FR靶向探针相比,检测结果一致,提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值Jiatao Lou,et al.Plos One 2013Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定22EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA荧光染料)上皮细胞白细胞抗抗 EpCAM 磁流体磁流
11、体EpCAM 抗原抗原CD45 抗原抗原CK 抗原抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料荧光染料荧光染料EpCAM阴性细胞中,存在大量CTC Cell Research系统主要使用EpCAM(上皮粘附分子)做为探针 研究证实,EpCAM阴性的细胞中也存在CTCJiatao Lou,et al.Plos One 20132004Cell Search:乳腺癌中检测出,但肺癌敏感性低2011Cell Research:采用的抗体采用的抗体(EpCAM)对对EMT细胞特异性差细胞特异性差,而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程l有报道,部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1l临床前研究证实,这
12、部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2l使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后,CTC的检测结果无明显改变31、He W,et al.Int J Cancer 2008;2、He W,et al.Proc Natl Acad Sci,2007;3、Jiatao Lou,et al.Plos One 2013CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术巨噬细胞(可能存在FR表达)不影响检测结果CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术同一患者重复检测,可重复性高CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l
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