ELISA--原理、方法及操作细节.ppt
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1、ELISAELISA酶联免疫吸附试酶联免疫吸附试验验导师:马学恩教授导师:马学恩教授2021/5/241ELISAELISA(酶联免疫吸附试验)(酶联免疫吸附试验)Enzymes linked immunosorbent assay2021/5/242简简 介介19711971年,瑞典学者年,瑞典学者EngvailEngvail和和PerlmannPerlmann、荷兰学者、荷兰学者Van SchuursVan Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,称为酶联免疫吸附微量物质的固相免疫测定方法,称为酶联免疫吸附试验。试验。E
2、LISA ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛,几乎所有的可溶性抗原该技术应用非常广泛,几乎所有的可溶性抗原-抗抗体系统均可用以检测。体系统均可用以检测。2021/5/243酶和抗体或抗原结合后,既不改变抗体与抗原酶和抗体或抗原结合后,既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型基质水解而呈色,或使
3、供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察,也可用分光光光学显微镜和电子显微镜观察,也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在,从度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在,从而证明发生了相应的免疫反应。而证明发生了相应的免疫反应。所以,这是一种特异而敏感的技术,可以在细所以,这是一种特异而敏感的技术,可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳米水平上对其进行定量。或在微克,甚至纳米水平上对其进行定量。2021/5/244基基 本本 原原 理理l
4、先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上,先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上,并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。l用洗涤的方法分离抗原用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。抗体复合物和游离成分。l 然后加入酶的作用底物催化显色,进行定性或定然后加入酶的作用底物催化显色,进行定性或定量。量。2021/5/245方方 法法 类类 型型酶联免疫吸附试验的主要技术类酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞型
5、有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。争法、捕获法等。2021/5/2461 1,双抗体夹心法:,双抗体夹心法:此法常用于检测抗原此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和和B分别与固相载体上的抗体分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体和酶标记抗体B结结合,形成合,形成抗体抗体A-待测抗原待测抗原-酶标抗体酶标抗体B复合物复合物,复合物的形成量与待测抗原含量成正比,属非复合物的形成量与待测抗原含量成正比,属非竞争性反应类型。竞争性反应类型。2021/5/247抗抗 体体 A A待测抗原待测抗原酶标抗体酶标抗体包被物包被物2021/5/2482
6、2,间接法测定抗体,间接法测定抗体此法常用于测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上,待测抗体与将已知抗原连接在固相载体上,待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合,形成抗原结合后再与酶标二抗结合,形成抗原抗原-待待测抗体测抗体-酶标二抗的复合物酶标二抗的复合物,复合物的形成量,复合物的形成量与待测抗体量成正比,属非竞争性反应类型。与待测抗体量成正比,属非竞争性反应类型。2021/5/249抗抗 原原待测抗体待测抗体酶标二抗酶标二抗包被物包被物2021/5/24103 3,竞,竞 争争 法法此法既可用于检测抗原和半抗原,此法既可用于检测抗原和半抗原,也可以用于检测抗体也可以用于检测抗体
7、用酶标抗原(抗体)与待测的非标记抗原用酶标抗原(抗体)与待测的非标记抗原(抗体)竞争性的与固相载体上的限量抗体(抗体)竞争性的与固相载体上的限量抗体(抗原)结合,待测抗原(抗体)多,则形(抗原)结合,待测抗原(抗体)多,则形成非标记复合物多,酶标抗原与抗体结合就成非标记复合物多,酶标抗原与抗体结合就少,也就是酶标记复合物少,因此,显色程少,也就是酶标记复合物少,因此,显色程度与待测物含量成反比。度与待测物含量成反比。2021/5/2411限量的的抗体限量的的抗体酶标抗原酶标抗原 样品抗原样品抗原酶标多于样品酶标多于样品显色程度深显色程度深样品多于酶标样品多于酶标显色程度浅显色程度浅显色程度与待
8、测物含量成反比显色程度与待测物含量成反比包被物包被物2021/5/24124 4,捕获法(反向间接法),捕获法(反向间接法)主要用于测定血清中某种抗体亚成分主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针对某测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性种抗原的特异性IgM和和IgG同时存在,而后者可同时存在,而后者可干扰干扰IgM的测定。因此,先针对的测定。因此,先针对IgM的第二抗体的第二抗体(如羊抗人如羊抗人IgM链抗体)连接于固相载体,用以链抗体)连接于固相载体,用以“捕获捕获”样品中所有样品中所有IgM;洗涤除去;洗涤除去IgG等无关等无关物质,然后加入
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