SN∕T 3566-2013 滤膜抽滤核酸提取方法(出入境检验检疫).pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 滤膜抽滤核酸提取方法犖 狌 犮 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犫 犪 狊 犲 犱狅 狀犿 犲 犿 犫 狉 犪 狀 犲 犳 犻 犾 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 祁军、 王馨、 左锋、 刘振宇、 柴宏森、 张霞、 詹曦菁、 魏永新、 李智慧、 尤其敏、 胡林、崔景柏。犛 犖犜 滤膜抽滤核酸提取方法范围本标准规定了滤膜法核酸快速提取技术的操作方法。本标准适用于检验检疫机构对病原体核酸的提取。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 食源性病原体 检测技术规范第部分： 定性检测方法样品制备要求缩略语下列缩略语适用于本文件。 ： 脱氧核糖核酸（ ） ： 核糖核酸（ ） ： 乙二胺四乙酸（ ） ： 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（ ） ： 焦碳酸二乙酯（ ） ： 核糖核酸水解酶 ： 核糖核酸酶抑制剂生物安全措施为了保护实验室人员的安全， 按照 中的有关规定， 应由具备相关资格的工作人员进行实验操作。所有废弃物也应按照 中的有关规定执行。方法原理滤膜法核酸快速提取技术提供了一种从各种生物样本中快速提取核酸的方法。滤膜抽滤核酸提取装置是利用滤膜可以特异性吸附核酸（ ） 的特点， 在样品进行裂解后， 利用装置对生物样品进行过滤、 吸附、 清洗及洗脱， 一次性提取核酸。本标准通过溶液的离子浓度和 值来控制滤膜抽滤核酸提取装置吸附和洗脱核酸的效率。本方法适用于食品、 食品接触面（ 包括人员手、 设备、 器具等食品直接接触表面） 和生物样品中病原体核酸（ ） 的提取。在提取 时， 滤膜抽滤核酸提取装置通用， 但在提取 时，使用的耗材和洗脱液需要经过特别处理， 以消除或减少 酶对 的降解。由于对于可疑入境人犛 犖犜 员及物品的检查只是初筛， 对其的确定性检测还是应依靠条件完善的实验室检测。因而尽管核酸提取对环境要求较高， 但只要保证检测时有独立且封闭的空间环境以及必要的试剂或仪器设施即可完成本方法的核酸提取过程。试剂和材料 除有特殊说明外， 所有实验用试剂均为分析纯。 实验用水符合 中一级水的要求。 裂解液： 见附录中 。 清洗液： 见附录中 。 清洗液： 见附录中 。 洗脱液： 见附录中 。 （ 处理痰液及脓性样本时使用） 。 生理盐水（ 处理分泌物拭子、 粪便时使用） 。 （ 提取 时使用） 。 （ 提取 时建议使用） 。 微量移液器： 体积范围为 ， 。 一次性注射器。 滤膜抽滤核酸提取装置： 由核酸提取装置和抽吸装置组成（ 见图 ） 。其中核酸提取装置内含有特异性吸附核酸的滤膜； 抽吸装置为一次性 注射器。 样本前处理装置（ 过滤器） ： 为样本进行核酸提取前进行杂质过滤的装置（ 见图 ） ， 分为进样口、 混匀区和出样口。在出样口处含有过滤膜， 可去除样本中的杂质。 离心管（ 处理分泌物拭子时使用） 。 离心管（ 处理粪便时使用） 。 痰瓶（ 处理痰液及脓性样本时使用） 。 离心管。 离心管。操作步骤 样本前处理 食品样本制备和增菌参照 中规定， 对食品样本进行取样和增菌， 取 增菌液备用。 食品接触面取样及前处理用一只被生理盐水浸湿的棉签在食品接触面上反复进行擦拭， 将擦拭后的棉签放在含有 生理盐水的 离心管中充分洗脱。洗脱液备用。 生物样品前处理 各种拭子： 将口腔咽部、 鼻部、 肛门、 阴道分泌物、 前列腺分泌液等样本用拭子取得后放在含有 生理盐水的 离心管中洗脱。洗脱液备用。 粪便： 取 的新鲜粪便或冰冻粪便至 离心管中， 加入 生理盐犛 犖犜 水， 充分振荡混匀， 室温静置 ， 留取 上清液备用。 痰液： 痰液需首先目测标本， 若唾液占绝大部分， 则需重新采集标本； 将合格痰液转移至痰瓶中， 加入倍体积的 充分振荡混匀 （ 视液化情况而定， 可多加 ， 但不可超过 倍） ， 室温下放置 左右液化， 静置期间可反复振荡混匀次以确保液化充分。取 液化后痰液备用。 脓性液体： 目测标本体积， 加入倍体积的 充分振荡混匀（ 视液化情况而定， 可多加 ， 但不可超过 倍） ， 室温下放置 左右液化， 静置期间可反复振荡混匀次以确保液化充分。取 液化后液体备用。 全血、 血清、 尿液、 胸水、 腹水、 脑脊液等液体样本无需处理， 取 备用。 裂解用微量移液器吸取 裂解液至样本前处理装置内， 然后再吸取 上述经过前处理的样本至前处理装置内， 盖上盖子并旋紧装置， 将其颠倒混匀， 使样本与裂解液在装置的混匀区内充分混匀， 并于室温静置 。 过滤用力挤压样本前处理装置， 将装置内的混合液通过出样口挤到一个 离心管内。 吸附利用滤膜抽滤核酸提取装置（ 已连接注射器） 缓慢吸取上述滤液， 样品完全经过滤膜后， 再将滤液经过滤膜重新推出， 弃掉。 清洗 利用上述滤膜抽滤核酸提取装置吸取清洗液 ， 待清洗液完全经过滤膜后， 再将滤液经过滤膜重新推出， 弃掉。 利用上述滤膜抽滤核酸提取装置吸取清洗液 ， 待清洗液完全经过滤膜后， 再将滤液经过滤膜重新推出， 弃掉； 用注射器缓慢抽推空气几次。 取下注射器， 将滤膜抽滤核酸提取装置常温静置 ， 最后再将注射器和滤膜抽滤核酸提取装置连接， 用注射器吸满空气再经滤膜推出， 以便充分去除膜中清洗液。 洗脱用微量移液器吸取 洗脱液在离心管内， 使洗脱液来回经过滤膜三次， 最后将收集的洗脱液保存， 供核酸扩增使用。操作要求 抽吸时速度要慢， 以防止液体经过提纯器时产生过多泡沫。 每次抽吸应尽量排空提纯器中的液体， 避免残留， 影响提取的效果。 抽吸遇到阻力时， 请缓慢抽拉注射器， 勿用力拔或拉注射器的活塞， 以防活塞被拔出， 造成样品污染。 用提取的核酸做初次扩增时， 建议进行梯度稀释， 以选择合适的浓度和模板量， 因为不同性质的样本提取核酸的效率不同。临床样品无需稀释， 直接用于扩增。 裂解液中含刺激性化合物， 操作时需戴乳胶手套， 避免沾染皮肤、 眼睛和衣服， 谨防吸入口鼻。若犛 犖犜 沾染皮肤、 眼睛， 要立即用大量清水或生理盐水冲洗， 必要时寻求医疗咨询。 为避免其他核酸的污染而出现假阳性， 应使用不含 和 的离心管、 吸管、 吸头、 试剂和手套， 操作人员戴口罩进行操作。提取 时， 应注意操作过程中更换手套。 如果提取的是 ， 请选用无 的吸头和离心管或将吸头和离心管用 的 水处理后再使用， 以避免纯化过程中病原体 被 所降解。质量控制操作者在应用滤膜抽滤核酸提取装置对样品中某种病原体进行核酸提取时， 建议同时对该病原体培养物进行核酸提取， 提取出的核酸作为阳性对照， 从而达到对滤膜抽滤核酸提取装置及其配套液体进行质量控制的目的。犛 犖犜 附录犃（ 规范性附录）微量核酸快速提取装置与样本前处理装置犃 微量核酸快速提取装置见图 。图犃 微量核酸快速提取装置犃 样本前处理装置见图 。图犃 样本前处理装置犛 犖犜 附录犅（ 规范性附录）溶 液 配 制犅 裂解液 异硫氰酸胍溶解于 （ ） 中， 随后加入 （ ） ， 混匀即可。配完后的液体体积约为 ， 需避光保存。如需配制其他量， 所有原料按比例增减即可。犅 清洗液犅 清洗液： 酒精。犅 清洗液： 无水乙醇。犅 洗脱液犅 洗脱液： （ ） 。犅 洗脱液： （ ） ， 应使用 水或无核酸酶的超纯水， 并建议在洗脱液中加入 。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准滤膜抽滤核酸提取方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元