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成年大鼠心肌细胞分离方法
【摘要】 目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法、程序冷冻后机械分离法、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。
【关键词】 大鼠; 心肌细胞; 细胞分离
【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(% trypsin and % collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rodshaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be isolated well with the above methods.
【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation
心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。目前乳鼠心肌细胞的分离方法比较成熟，但是由于未成熟心肌细胞和成熟心肌细胞的差异性使得大量来自于未成熟心肌细胞实验的结论难以用于成熟心肌细胞。特别是近年来, 随着心肌细胞电生理和分子生物学研究的兴起，成熟心肌细胞越来越多的应用于心血管病理生理的研究。目前分离成熟心肌细胞应用较多的是Langendorff 灌流胶原酶消化法，但是它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只想了解部分心肌细胞功能时就显示出其局限性，我们根据文献的方法加以改进，探讨三种简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，为研究心肌细胞生理和病理特性提供了有用的实验模型。
1 材料与方法
　酶消化法
　动物 健康雄性Wister大鼠，军事医学科学卫生与环境医学研究所提供。
　试剂 0. 1%胰蛋白酶, 0. 1%胶原酶Ⅰ(GIBCO) (两种酶均用DHanks 液配制成0. 1 %的液体,经正压过滤除菌,pH7. 2, - 20 ℃保存)，DHanks 液,用双蒸去离子水配制，,高压蒸气灭菌,4 ℃保存。培养液[10%DMEM(GIBCO) 干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7. 2～7. 4, - 20 ℃保存。
　主要器材 光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)
　心肌细胞分离
大鼠用25%乌拉坦腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织立即放入预冷的DHanks 液中,冲洗3次。将心室肌用眼科剪剪成1 mm3 大小组织块,然后加入0. 1 %胰蛋白酶溶液10 ml,37 ℃水浴8min 后,吸取上层混悬液移弃。再加入0. 1 %胶原酶溶液15ml，37 ℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min 后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM中终止反应。剩余沉淀物再加0. 1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后, 吸取全部液体，终止反应。混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。
　程序冷冻后机械法
　动物 同上。
　试剂 DMEM (GIBCO)，Ficoll(Pharmacia) ，KrebsHenseleit 缓冲液，蒸馏水溶解后，经μm滤膜抽滤消毒，备用。 PBS, 蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备用。
1.　主要仪器 FA21045N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司), B600型离心机，光学显微镜等。
　心肌细胞的分离 大鼠麻醉后，开胸迅速取心脏，将待测部分左心室放在60%甘油的DMEM的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻。用DMEM清洗心脏，将左心室剪碎成1mm3的小块，于KH液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复一次。将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800转/min离心5min，清洗两次，800转/min离心。将沉淀轻轻加入4%的Ficoll上，400转/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状心肌细胞。
　　　酒精和多聚甲醛固定后机械法
　动物 同上。
　主要仪器 100目、300目筛子，眼科剪刀，眼科镊子，平皿，离心机等。
　单细胞悬液的制备 将待测心肌组织用生理盐水冲洗后置于70%酒精和4%多聚甲醛溶液(0. 1M pH7. 4)固定，4℃冰箱保存备用。将酒精固定的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，以500～800转/min离心沉淀2min。时间允许也可以在取下组织后立即进行悬液的制备，然后用70%冷乙醇固定备用。
　心肌细胞的观察和评价
分离的心肌细胞置于显微镜下进行形态学观察, 结合%台盼蓝染色评价心肌细胞活性,计数活性细胞比例。
2 结果
本方法可获得70%～80%具有活性的成年大鼠心室肌细胞(图1～3)。新分离的存活单个成年大鼠心室肌细胞呈杆状或矩形, 横纹清晰, 菱角分明, 长宽比约4～5∶1。由于活性细胞的细胞膜完整, 所以台盼蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞呈团块状, 由于细胞膜缺乏完整性, 被台盼蓝染成蓝色。
2007年2月李淑娟等：成年大鼠心肌细胞分离方法第1期2007年2月河北北方学院学报第1期图1 成年大鼠心室肌细胞图2 成年大鼠心室肌细胞图3 成年大鼠心室肌细胞
3 讨论
目前分离心肌细胞的方法主要有酶消化法和机械收集法。文献报道最多的是Langendorff逆行主动脉灌注酶溶液消化的方法,但由于技术条件要求较高,收获细胞的质和量差异较大,尤其在我国进行成熟心肌细胞分离培养的单位尚少,成功率也较低，而且它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只对处理过的局部心肌细胞感兴趣，这就显示出它的局限性，比如在对部分缺血处理过的心肌细胞用流式细胞仪测定细胞凋亡情况时就要先分理出缺血心肌，再制成细胞悬液，进行测定。另外，它由于要求取下完整的心脏，该方法难用于人心肌细胞的分离，应用具有局限性，也是其一大缺点。我们以上三种方法正是适应此目的而将文献中的方法加以改进，建立了分离心肌细胞的模型。
酶消化法：成年大鼠的心脏与新生鼠的心脏结构不同，细胞外基质丰富，且细胞间连接紧密，难分离。在本试验的酶消化法中，先用胰蛋白酶，主要用于分解组织间质的蛋白成分，心肌细胞间糖蛋白被破坏，桥粒和连结随之解离。但是由于此酶作用较强，要严格控制消化时间，一般8～10min即可，另外要弃掉上清，因为其中大多数为非心肌细胞。然后在沉淀中再加胶原酶，胶原酶作用较缓和，主要用于消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞，它和胰蛋白酶依次使用可以互相弥补，充分分离细胞，并且缩短时间，提高细胞存活率。应用生物酶浸泡已被剪成极小碎块的组织，使其渗入细胞间质以分离出心肌细胞，但是由于在酶渗透过程中，对心肌细胞间质作用时间的不均一性，对外表的心肌细胞破坏严重，故分离心肌细胞时应严格控制分离时间，并且应用磁力搅拌器。
机械法：生物酶灌流的方法，特别是在研究心肌细胞的特性时，运用此方法细胞产量高，可以有效地保持心肌细胞的生理特性，尽可能的避免发生钙反常现象而导致心肌细胞的死亡，然而，该方法需要昂贵的Langdorff装置，而且在随后的细胞固定过程中，心肌细胞发生严重的聚集，而无法继续试验，分析其聚集的原因，可能与细胞分离过程中心肌细胞膜受损等有关。所以，此方法更适用于急性分离细胞后立即使用的实验。心脏在液氮中保存后再机械分离，发现分离出足够数量的杆状心肌细胞，形态、大小各异，而且在随后的固定过程中，只要细胞数量适当，心肌细胞不再聚集成团，其原因不甚明了，可能与液氮引起心肌细胞间质发生变化，心肌细胞间连接变得较为疏松以及甘油的细胞膜保护作用等有关，其机制有待进一步研究。HE染色后呈现明显的横纹，而且完全可以顺利地完成标记和流式细胞仪的检测，证明该方法是行之有效的，至少在利用流式细胞仪检测心肌细胞各种指标时，该方法不失为一种单心肌细胞悬液的制备技术。另外，我们也探索了先用酒精和多聚甲醛固定标本后，再用机械法分离细胞，虽然得到的细胞数量稍少，但是只要增大组织块的取材量，分离的细胞足以进行下一步的测定。如果时间允许也可以将新鲜标本直接研磨得到的细胞用酒精固定后再进行检测，但是细胞不宜长时间保留，否则会造成细胞集聚成团，不利于测定。
综上所述，三种方法各有利弊，酶消化法得到的细胞数量多，活性强，但是步骤稍多；机械法得到的细胞数量少，但是方法简单，而且在动物经过预处理后，可以先将标本保留，成批作细胞悬液，减少组间差异。总之，实验者可根据实际情况采取相应的方法。
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