GA∕T 121-2019 法庭科学 生物检材中斑蝥素检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 代替GA/T 121-1995 法庭科学 生物检材中斑蝥素检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for cantharidin in biological samplesGC and GC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准代替 GA/T 121-1995中毒检材中斑蝥素的定性定量分析方法，与 GA/T 121-1995 相比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改了标准名称（见封面，1995 年版封面）； 删除了气相色谱检验法（见 1995 年版第一篇）； 删除了薄层色谱检验方法（见 1995 年版第二篇）； 修改了仪器和材料有关内容（见第 5 章和第 6 章，见 1995 年版第 5 章）； 增加了气相色谱-质谱检验方法（见第 7 章）； 增加了液相色谱-串联质谱检验方法（见第 7 章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、山西医科大学、司法部司法鉴定科学技术研究所。 本标准起草人：黄健、张蕾萍、杜鸿雁、栾玉静、董颖、张云峰、王芳琳、于忠山、贠克明、王玉瑾、刘伟。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中斑蝥素检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱方法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材 （血、 尿、 肝、 肾、 胃及胃内容等） 中斑蝥素的气相色谱-质谱 （GC-MS）和液相色谱-质谱(LC-MS)定性定量检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中斑蝥素的定性分析和定量分析。 其他可疑样品中斑蝥素的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩后，采用气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法定性定量， 以保留时间、 质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 气相色谱-质谱实验用水应符合GB/T 6682 中规定的三级水，液相色谱-串联质谱实验用水应符合GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 二氯甲烷； b) 乙酸乙酯； c) 盐酸； d) 甲醇（色谱纯）； e) 乙腈（色谱纯）； h) 甲酸（色谱纯）； f) 甲酸/甲酸铵缓冲液（pH值3.5）：量取3.77mL甲酸、称取6.30g甲酸铵，加入去离子水振荡至溶解，定容至1000mL，混匀； g) 标准溶液： GA/T 2 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据斑蝥素标准物质的纯度，称取适量，用甲醇配制1.0mg/mL 斑蝥素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 0.1mg/mL标准工作溶液： 移取1.0mg/mL的斑蝥素标准物质溶液1.0mL， 用甲醇定容至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由0.1mg/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括有： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管； c) pH 试纸：范围 114； d) 固相萃取柱：Oasis HLB 柱或等效固相萃取柱：依次以甲醇、水活化； 注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 e) 有机系微孔滤膜：0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI） ； b) 液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器； c) 电子天平； d) 移液器； e) 超声波清洗器； f) 振荡器； g) 离心机； h) 浓缩仪。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 取血液、尿液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g于具盖离心管中，加入甲酸/甲酸铵缓冲液调pH至34，振荡，再加入二氯甲烷或乙酸乙酯3mL5mL，振荡10min，8000r/min离心10min，分离有机相；重复提取一次，分离合并两次提取的有机相，置于浓缩器上50浓缩至干。 残留物用甲醇50L100L溶解， 作为检材样品提取液供GC-MS分析或用甲醇500 L溶解，经0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。 7.1.1.2 固相萃取(适用于新鲜样品) GA/T 3 取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g，加入1%盐酸溶液4mL8mL于具盖离心管中，混旋，超声15min，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中，控制上清液过柱流速为0.5mL/min1.0mL/min；再用水6mL淋洗后，弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱2min，用甲醇4mL洗脱，收集洗脱液置于浓缩器上40浓缩至干，残留物用甲醇50 L100 L溶解, 作为检材样品提取液供GC-MS分析或用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加斑蝥素标准物质，作为添加样品（GC-MS添加样品的浓度为1 g/mL(g)，LC-MS添加样品的浓度为10ng/mL(g)），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱-质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：DB-5MS 柱（30m 0.32mm 0.25m）或等效色谱柱； 注：DB-5MS 柱是 Aglient 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程：100保持 2min，以 15/min 速率升温至 280，保持 17min； c) 进样口温度：280； d) 传输线温度：230； e) 离子源温度：200； f) 载气：高纯氦气； g) 柱流量：1mL/min2mL/min； h) 分流比：5:150:1； i) 质量扫描范围：40amu450amu； j) 扫描方式：全扫描（Scan），定量离子：m/z: 128，定性离子：m/z: 96。 7.1.2.1.2 液相色谱-质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm 100mm,1.8m)柱或等效色谱柱； 注：ZORBAX Eclipse Plus C18柱是 Aglient 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相及梯度洗脱条件：见表 1； 表 1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min 流动相 A （0.1%甲酸水） 流动相 B （乙腈） 0.1 0.4 90% 10% 1.0 0.4 10% 90% 2.0 0.4 10% 90% GA/T 4 2.1 0.4 90% 10% 4.2 0.4 90% 10% c) 离子源：电喷雾电离源（ESI）； d) 检测方式：正离子； e) 检测方式：多反应离子监测（MRM）； f) 电喷雾电压：5500 KV； g) 离子源温度：650； h) 雾化气压力：55psi； i) 气帘气压力：30psi； j) 辅助气压力：50psi； k) MS 参考条件（检测离子对、去簇电压、碰撞能量等）见表 2。 表 2 MS 参考条件 名称 保留时间 min 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 斑蝥素 1.47 197.1 123.1 197.1 123.1 110 20 197.1 107.0 110 16 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g两份，按7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份， 其中两份分别添加斑蝥素标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)% ），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量： GA/T 5 添样添样添样VMAVMAW= . (1) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（g/mL） ； A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值； M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g） ； V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL） ； A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值； M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL） ； V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差： %10021=XXXRD . (2) 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 气相色谱-质谱 阳性结果评价： 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3个）与标准溶液一致，特征离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 3 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 阴性结果评价： 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参加附录 A。 8.1.2 液相色谱-质谱 阳性结果评价： 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表4规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 GA/T 6 表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价： 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。 斑蝥素的理化性质和相关谱图参见附录 A。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 斑蝥素的检出限、理化性质和相关谱图 A.1 方法检出限 LC-MS分析，检出限为10ng/mL（g）。GC-MS分析检出限为1g/ mL（g）。 A.2 斑蝥素的理化性质 斑蝥素来源于昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥干燥虫体。 斑蝥素分子结构见图 A.1， 分子式： C10H12O4，分子量：196.202，化学名：六氢-3a,7a-二甲基-4,7-氧桥异苯并呋喃-1,3-二酮。斑蝥素为具有反光的鳞片状结晶，无色，无臭，不溶于冷水，溶于丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯。动物实验表明，LD50（小鼠）2.1mg/kg。 斑蝥素在中药中为辛、寒、有毒之品，具有破血散结功能，毒性较大，主要表现为泌尿系统及消化道的刺激作用。如果滥用、超量应用、与酒蒜同用、生用(或泡制不当)、外用面积过大、冲服会引起中毒。 图 A.1 斑蝥素分子结构 A.3 斑蝥素的相关谱图 斑蝥素的相关谱图见图 A.2图 A.4。 图 A.2 斑蝥素的气相色谱质谱总离子流图GA/T 8 501001502002503003504004505005500100%961284170143256386171281353494207535415237316450 图 A.3 斑蝥素的质谱图 图 A.4 斑蝥素的液相色谱质谱提取离子流图 A.4 斑蝥素的相关数据 血液样品中斑蝥素检出限见表A.1。 表A.1 血液样品中斑蝥素检出限 单位为纳克每毫升（ng/mL） 斑蝥素 GC-MS LC-MS/MS 血液 100 10 _