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实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4SARS-CoV-2核酸提取前样本混匀后不同静置时间对假阴性结果影响的初步探讨梁丽霞（肇庆市第一人民医院检验科，广东肇庆52 6 0 6 0)摘要：目的探讨新型冠状病毒在治疗初期和治疗后期的核酸检测情况，分析假阴性结果出现的实验因素。方法所有样本来源于1 例COVID-19确诊病例患者在住院治疗期间,人院后治疗的前 6 d设为治疗初期,这期间送检的 6 个鼻咽拭子编号为1、2、3、4、5、6,设为A组。在出院前一周的治疗设为治疗后期，这期间送检的6 个鼻咽子编号为7、8、9、10、11、12,设为B组。将A组和B组的12 个样本充分混匀后,每个样本以每管2 0 0 ul的液量分装到四个不同的1.5mLEP管中，第一管即刻加样提取，第二管静置5min加样提取，第三管静置15min加样提取，第四管静置30 min加样提取,RT-PCR扩增。用Pearson积矩相关分析比较A组的N基因和ORFlab基因 Ct值的相关系数,并用 MedCalc软件绘制Bland-Altman曲线进行一致性分析。用Excel2016比较B组的结果。结果治疗初期A组N基因Ct值0 min与其余3种静置时间两两比较，结果具有较好的一致性；而ORFlab基因 Ct值0 min与30 min一致性较差。治疗后期B组中同一个样本的N基因和ORF1ab基因在加样提取前因静置时间不同而出现不同的结果,甚至出现了假阴性结果。结论样本静置时间对扩增检测结果有影响,治疗后期和疑似患者的样本应充分震荡并静置30 min后再进行提取和扩增实验。关键词：新型冠状病毒；核酸检测；静置时间；提取；假阴性中图分类号：R563.1文献标识码：A文章编号：16 7 4-112 9(2 0 2 3)0 4-0 39 9-0 5D0I:10.3969/j.issn.1674-1129.2023.04.005Preliminary study on the effect of different standing time on false negative results after mixing samples before extractionof SARS-CoV-2 nucleic acid LIANG Lixia.Clinical Laboratory of the First Peoples Hospital of Zhaoqing,Guangdong,Zhao-Qing,526060,China.Abstract:Objective To investigate the nucleic acid detection of novel coronavirus in the initial stage and post-period ofCOVID-19 treatment and analyze the experimental factors of false negative results.Method All samples were from a patient witha confirmed case of COVID-19 during hospitalization.The first 6 days of treatment after admission were set as the initial stage oftreatment.The 6 nasopharyngeal swabs sent during this period were numbered 1,2,3,4,5,6,and were set as group A.The treatmentof the week before discharge was set as the later stage of treatment.During this period,6 nasopharyngeal swabs numbered 7,8,9,10,11 and 12 were sent for inspection,which were set as group B.After fully mixing 12 samples of group A and group B,eachsample was divided into four different 1.5 ml EP tubes with 200 uL liquid volume per tube.The first tube was immediately addedand extracted,the second tube was placed for 5 min and extracted,the third tube was placed for 15 min and extracted,and thefourth tube was placed for 30 min and extracted,RT-PCR amplification.Pearson product moment correlation analysis was used tocompare the correlation coefficient between Ct values of N gene and ORF1 ab gene in group A,and Bland-Altman curve wasdrawn by MedCalc software for consistency analysis.Excel 2016 was used to compare the results of group B.Results The Ct val-ue of N gene with O min in group A.Group A with the initial stage of treatment was compared with the other three standing time,the results had good consistency,while the Ct value of ORFlab gene O min and 30 min had poor consistency.The N gene andORFlab gene of the same sample in group B in post-period of treatment had different results due to the different standing timebefore the sample extraction,and even had false negative results.Conclusion The standing time of the sample has an effect onthe amplification test results.Especially the samples in the post stage of treatment and suspected cases should be fully shaken andstanding for 30 minutes before proceeding with the extraction and amplification experiment.Key words:SARS-CoV-2;Nucleic acid testing;Standing time;RNA extraction;False negative results基金项目：广东省科技专项课题专题七，新型冠状病毒肺炎防控科技攻关项目，编号2 0 2 0 N7004作者简介：梁丽霞，副主任技师。研究方向：微生物分子生物学检测。399.实验研究400.SARS-CoV-2核酸 RT-PCR是目前 COVID-19病的确诊方法,但影响检测结果的因素较多。我们在实验室核酸检测工作中发现，样本提取前充分振荡混匀后静置时间对治疗后期或恢复期的确诊患者的实验结果有着很大的影响。在患者治疗后期及恢复期，病毒量急剧减少，但仍有少量存留于鼻咽内部细胞的情况下，不同的样本处理方法决定着结果的可靠性。实验结果报告如下：1材料与方法1.1 材料1.1.1试剂与仪器3mL自带灭活效果的病毒保存液（广州邦德盛生物科技有限公司），去RNA酶EP管（AXYGEN），半自动核酸提取仪（重庆中元汇吉生物技术有限公司)和配套的核酸提取试剂盒(磁珠法，型号B-200),SARS-CoV-2核酸检测试剂盒（荧光PCR法，中山大学达安基因股份有限公司），ABI7500 PCR 仪(Applied Biosystems USA)。1.1.2样本来源样本来源于本院收治的1例女性COVID-19确诊患者，该患者住院时间是2 0 2 0 年2月17 日至3月5日，人院前鼻塞、流沸、咽痛8天，咳嗽7 天，发热3天，新型冠状病毒核酸检测结果阳性,胸部CT平扫结果提示左肺上叶少许炎症。在此病人住院治疗期间,感染科医生为了监测治疗效果，在病人签署知情同意书的情况下，每天采集一个鼻咽拭子到我们实验室进行新型冠状病毒核酸检测，采集后的样本立即保存在灭活病毒保存管中,4保存及时送检。将此病人入院后治疗的前6 d设为治疗初期,这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为1、2、3、4、5、6,设为A组。在出院前一周的治疗设为治疗后期，这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为7、8、9、10、11、12,设为B组。1.2方法1.2.1加样提取操作实验人员严格按照国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)的通知及新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版)相关文件进行实验操作和生物安全防护。取出含提取试剂9 6 孔的深孔板平衡至室温，小心撕开铝膜，样本孔位依次加入15uL的Pro-teinase K。将A组和B组的12 个3mL的样本充分混匀后，每个样本以每管2 0 0 uL的液量分装到四个不同的1.5mLEP管中。实验的步骤如下：实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine，A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4文中将以0 min、5mi n、15mi n、30 mi n 表示不同的静置时间。1.2.2核酸扩增使用PCR仪,根据核酸检测试剂盒说明书设置反应程序，利用一步法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,选取SARS-CoV-2病毒的ORF1ab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针用于SARS-CoV-2检测。试剂盒同时包括了内源性内标系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控。1.2.3PCR反应条件50 的初始反转录15min，紧随9 5变性步骤15 min,随后进行 45次9 4循环15s,55 45s,最后一步40 2 0 s。1.2.4结果判定阴性结果:N基因和ORF1ab基因无典型S型扩增曲线或Ct40,且Cy5通道有明显扩增曲线；阳性结果：（N基因和ORFlab基因Ct40,且有典型的S型扩增曲线。如果N基因或ORF1ab基因Ct40，）复检后结果一致可判为阳性。要求阴性质控和阳性质控均在控。1.2.5统计学方法比较扩增后A组N基因和ORFlab基因Ct,Pearson积矩相关分析不同标本之间的 CT系数,graphpad5.0对图形进行了说明，MedCalc软件绘制Bland-Altman曲线,并对CT进行一致性分析,P0.05为差异有统计学意义。因B组部分样本N基因和ORF1ab基因结果出现假阴性结果，没有Ct,只能用excel2016比较阳性率。本研究采用统计分析软件spss19.0。2结果2.1治疗初期A组提取核酸前不同静置时间处理的Ct:见表1。2.2相关分析治疗初期A组的6 个样本0 min与5min、15m i n、30 m i n 扩增后Ct的相关分析,结果如表2。N基因CtOmin和5min比较差异有统计学意义(P0.05)。O R F1a b 基因 Ct min与5min、15m i n 比较有统计学差异（P0.05）。随着标本静置时间不断延长，相关系数就越小，比较差异无统计学意义。见图1。2.3一致性分析样本充分混匀即刻加样提取(0(1)第一管立刻进行提取；(2)第二管静置5min后进行提取；(3)第三管静置15min后进行提取；(4)第四管静置30 min后进行提取。实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4标本号N129.96231.82331.04426.7533.99629.38表2 COVID-19确诊患者治疗初期A组样本提取核酸前不同时间处理方式的Ct相关性分析ORF1ab0min5min10.956P0.05401/=0.956,p=0.00319)10A2525401T=0.468,p=0.34935ZC25+25401(uIwr=0.852,p=0.031401.表1COVID-19确诊患者治疗初期A组样本提取核酸前不同静置时间处理的Ct0minNORF1ab32.2935.8633.2732.7835.3332.660.054025451r=0.85,p=0.0328ue6D30+4030401r=0.064,p=0.90415 minNORF1ab29.3733.3434.1234.630.2833.0129.5533.8131.5434.8229.4132.7230 min0 min0.46810.050.05man曲线所示,N基因的Ct,0min与其余3种不同静置时间进行两两比较，图中所有的点都在95%LoA之内,认为方法之间结果具有较好的一致性。（ORF1ab基因的Ct都在混匀后静置30 min提取有16.7%(1/6)的散点分布在9 5%CI之外，)样本充分混匀即刻加样提取0 min与静置30 min提取两种方法的一致性较差。3035NgeneCt(Omin)35ORF1ab geneCt(0min)30 minORF1ab32.0633.5729.0332.1630.8534.0627.6333.0130.3734.8429.5632.455min15 min0.8500.8520.050.050231.96SDBAverage+1.86SD4.890.57-1.86SD3.7630Averoge-1.35-1012D3436Avenge4096S0.7530+E30ORF1ab geneCt(0 min)图1治疗初期A组0 min与其他三种不同静置时间提取的Ct相关性分析(N基因和ORF1ab)min)与混匀后静置5min、15m i n、30 m i n 提取扩增后Ct的一致性分析。纵轴是Omin与其他三种处理方式的差值，横轴是平均值。如图2 Bland-Alt-198SD38140F30303535ORF1ab gene Ct(0min)40Mean0.01836SDE图2 治疗初期A组混匀即刻加样提取(Omin）与不同静置时间的相关性分析图图例：横轴表示混匀即刻加样提取(Omin）的Ct值，纵轴表示不同静置时间提取样本的Ct值(N基因和ORF1ab）035LAverage.402.处理的Ct:见表3。图3、图4和图5所示，治疗后期的同一个样本N基因和ORF1ab基因由于提取前静置时间不同而出现假阴性的结果。在静置30min加样提取,它的阳性率结果是最高的。80%60%40%20%0%250200150100500图4治疗后期B组样本不同处理方式N基因Ct变化折线图3讨论病毒保存溶液通常分为非灭活型和灭活型非灭活型能够保护病毒的蛋白质和核酸，收集样品后，必须严格遵循低温条件才能长期保存。灭活型主要是从核酸提取裂解物中改良的病毒裂解型包含RNase酶抑制剂的保存溶液，有助于保护病毒核酸不被降解，可以在室温下保存相对较长的时间。我院曾报道灭活型和非灭活型的样本，在检表3COVID-19确诊患者治疗后期 B组样本提取核酸前不同静置时间处理的 Ct0min标本号N789101112注：“-表示阴性。实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4Omin5minNORF1ab图3治疗后期B组样本不同处理方式N和ORF1ab基因阳性率比较柱状图O.min5mim89+10+11一125minORF1abN40.1935.0637.0435.4918016014012010080604020015mini30min15min30min37.336.03omin78+910+11+12图5治疗后期B组样本不同处理方式ORF1ab基因Ct变化折线图测新型冠状病毒RNA上无论是N基因还是ORF1ab基因结果都具有一致性2。然而也有研究表明，病毒灭活过程对于病毒含量较高的样本检出率无显著影响，但可能会导致病毒含量较低样本的检出率下降,从而产生假阴性结果3。考虑到SARS-COV-2潜在致病能力较强，在实验室生物安全水平有限的情况下必须进行病毒灭活过程，但应尽量准确控制灭活的温度和时间，以避免因高温度或长时间的灭活过程而导致检出率严重下降的情况(4-6 。COVID-19患者存在康复后复发和无症状感染等现象。一项关于回顾性分析3例COVID-19患者出院后核酸检测结果复阳的研究指出，患者感染初期的SARS-CoV-2ORF1ab和N基因的核酸检测结果呈双基因强阳性，二次入院时报告双基因为弱阳性，提示了患者复阳的病毒载量远低于首次入院时的病毒载量。本文通过对治疗初期A组与治疗后期B组样本经不同样本处置方式，发现COVID-19患者因不同病毒载量而影响了结果。在患者的治疗初期,由于其病毒核酸载量比较高，样本振荡后不同静置时间对结果无影响。然而,在治疗后期，同一样本因提取前不同的静置时15minORF1abN34.0340.440.345.mimORF1ab37.9215min30minNORF1ab44.5734.8433.5841.3735.2132.2530min4337.0939.1239.89实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4间而出现截然不同的结果，放置30 min后提取的结果阳性率却是最高的，这说明了样本提取前不同的处置方法对假阴性结果有一定的影响。实验前标本保存液总量是3mL，实验前有无振荡对结果的影响不大，结果与病毒核酸载量以及与在采样管中的悬浮性有关。另一方面,体外诊断试剂的分析敏感性是有极限的8,原始标本中病毒数量低于一定程度，就很可能在核酸扩增检测的反应体系中没有病毒核酸，试剂也就无法检出，试剂因素也是影响实验结果的重要因素之一，尤其是当样本有不同的处理方式时，试剂因素对实验结果的影响就突显出来了。有报道称,COVID-19 患者在症状消失后的一段时间内仍可检测出病毒的RNA9-10。冯毅叫报道了湖北武钢第二职工医院38 例确诊病例同步检测咽拭子核酸检测和胸部CT，第1次核酸检测阳性病例9 例，第2 次核酸检测结果阳性病例2 5例,第3次核酸检测结果阳性病例4 例。LAN等 12 研究证实，4例COVID-19患者在出院5 13d后出现核酸“复阳”。COVID-19患者经过治疗症状消失后，排毒仍继续，体内仍携带较低滴度的病毒，这可能与病程不同阶段的核酸载量有关。另一方面，核酸检测试剂的灵敏度、实验人员的操作方法等实验因素也会导致核酸漏检和假阴性，使部分患者在痊愈前出院，导致出现“复阳 现象13-14。有研究分析了出院前连续核酸检测阴性次数对出院后复阳的影响，结果显示连续3次及以上核酸检测阴性可大大降低复阳比例，这对今后的疫情防控有很好的提示作用 5。新型冠状病毒核酸检测应严格按照SOP进行实验，采样使用灭活采样管，尤其是疾病治疗后期和疑似病例的样本应充分震荡并静置30 min后再进行下一步提取和扩增实验，这样做能有效避免气溶胶的发生，也对避免假阴性结果具有一定的应用价值。我们医院收治的新型冠状病毒患者数量不多，本研究存在一定的局限性，研究结论尚需403.进一步验证。参考文献1WANG D,HU B,HU C,et al.Clinical characteristics of 138 hospi-talized patients with 2019 novel coronavirus infected pneumonia inwuhan,ChinaJJ.JAMA,2020,323(11):1061-1069.2Yueying W,Song W,Zhao Z,et al.The impacts of viral inactivat-ing methods On quantitative RT-PCR for COVID-19J.Virus Res,2020,285:197988.3段秀枝,王旭楚,俞攀,等.病毒灭活处理对 2 0 19 新型冠状病毒核酸检测弱阳性结果的影响 J.中华检验医学杂志,2 0 2 0,43(4):358-363.4李彩玉,陈梦媛,张师音,等.新型冠状病毒核酸检测假阴性原因分析及控制要点 .厦门大学学报(自然科学版),2 0 2 0,59(3):310-316.5陈翊,连广琬,郑玲玲,等.含胍盐灭活保存管在2 0 19 新型冠状病毒实时荧光PCR检测中的应用 J.中华临床实验室管理电子杂志,2 0 2 0,8(2):9 4-9 9.6严谨,陈小凤,熊金萍,等,不同灭活温度对新型冠状病毒核酸检测的影响 J.检验医学与临床,2 0 2 1,18(2):2 14-2 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