SARS-CoV-2核酸提取前样本混匀后不同静置时间对假阴性结果影响的初步探讨.pdf
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1、实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4SARS-CoV-2核酸提取前样本混匀后不同静置时间对假阴性结果影响的初步探讨梁丽霞(肇庆市第一人民医院检验科,广东肇庆52 6 0 6 0)摘要:目的探讨新型冠状病毒在治疗初期和治疗后期的核酸检测情况,分析假阴性结果出现的实验因素。方法所有样本来源于1 例COVID-19确诊病例患者在住院治疗期间,人院后治疗的前 6 d设为治疗初期,这期间送检的 6 个鼻咽拭子编号为1、2、3、4、5、6,设为A组。在出院前一周的治疗设为治疗后期
2、,这期间送检的6 个鼻咽子编号为7、8、9、10、11、12,设为B组。将A组和B组的12 个样本充分混匀后,每个样本以每管2 0 0 ul的液量分装到四个不同的1.5mLEP管中,第一管即刻加样提取,第二管静置5min加样提取,第三管静置15min加样提取,第四管静置30 min加样提取,RT-PCR扩增。用Pearson积矩相关分析比较A组的N基因和ORFlab基因 Ct值的相关系数,并用 MedCalc软件绘制Bland-Altman曲线进行一致性分析。用Excel2016比较B组的结果。结果治疗初期A组N基因Ct值0 min与其余3种静置时间两两比较,结果具有较好的一致性;而ORFla
3、b基因 Ct值0 min与30 min一致性较差。治疗后期B组中同一个样本的N基因和ORF1ab基因在加样提取前因静置时间不同而出现不同的结果,甚至出现了假阴性结果。结论样本静置时间对扩增检测结果有影响,治疗后期和疑似患者的样本应充分震荡并静置30 min后再进行提取和扩增实验。关键词:新型冠状病毒;核酸检测;静置时间;提取;假阴性中图分类号:R563.1文献标识码:A文章编号:16 7 4-112 9(2 0 2 3)0 4-0 39 9-0 5D0I:10.3969/j.issn.1674-1129.2023.04.005Preliminary study on the effect of
4、 different standing time on false negative results after mixing samples before extractionof SARS-CoV-2 nucleic acid LIANG Lixia.Clinical Laboratory of the First Peoples Hospital of Zhaoqing,Guangdong,Zhao-Qing,526060,China.Abstract:Objective To investigate the nucleic acid detection of novel coronav
5、irus in the initial stage and post-period ofCOVID-19 treatment and analyze the experimental factors of false negative results.Method All samples were from a patient witha confirmed case of COVID-19 during hospitalization.The first 6 days of treatment after admission were set as the initial stage oft
6、reatment.The 6 nasopharyngeal swabs sent during this period were numbered 1,2,3,4,5,6,and were set as group A.The treatmentof the week before discharge was set as the later stage of treatment.During this period,6 nasopharyngeal swabs numbered 7,8,9,10,11 and 12 were sent for inspection,which were se
7、t as group B.After fully mixing 12 samples of group A and group B,eachsample was divided into four different 1.5 ml EP tubes with 200 uL liquid volume per tube.The first tube was immediately addedand extracted,the second tube was placed for 5 min and extracted,the third tube was placed for 15 min an
8、d extracted,and thefourth tube was placed for 30 min and extracted,RT-PCR amplification.Pearson product moment correlation analysis was used tocompare the correlation coefficient between Ct values of N gene and ORF1 ab gene in group A,and Bland-Altman curve wasdrawn by MedCalc software for consisten
9、cy analysis.Excel 2016 was used to compare the results of group B.Results The Ct val-ue of N gene with O min in group A.Group A with the initial stage of treatment was compared with the other three standing time,the results had good consistency,while the Ct value of ORFlab gene O min and 30 min had
10、poor consistency.The N gene andORFlab gene of the same sample in group B in post-period of treatment had different results due to the different standing timebefore the sample extraction,and even had false negative results.Conclusion The standing time of the sample has an effect onthe amplification t
11、est results.Especially the samples in the post stage of treatment and suspected cases should be fully shaken andstanding for 30 minutes before proceeding with the extraction and amplification experiment.Key words:SARS-CoV-2;Nucleic acid testing;Standing time;RNA extraction;False negative results基金项目
12、:广东省科技专项课题专题七,新型冠状病毒肺炎防控科技攻关项目,编号2 0 2 0 N7004作者简介:梁丽霞,副主任技师。研究方向:微生物分子生物学检测。399.实验研究400.SARS-CoV-2核酸 RT-PCR是目前 COVID-19病的确诊方法,但影响检测结果的因素较多。我们在实验室核酸检测工作中发现,样本提取前充分振荡混匀后静置时间对治疗后期或恢复期的确诊患者的实验结果有着很大的影响。在患者治疗后期及恢复期,病毒量急剧减少,但仍有少量存留于鼻咽内部细胞的情况下,不同的样本处理方法决定着结果的可靠性。实验结果报告如下:1材料与方法1.1 材料1.1.1试剂与仪器3mL自带灭活效果的病毒
13、保存液(广州邦德盛生物科技有限公司),去RNA酶EP管(AXYGEN),半自动核酸提取仪(重庆中元汇吉生物技术有限公司)和配套的核酸提取试剂盒(磁珠法,型号B-200),SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(荧光PCR法,中山大学达安基因股份有限公司),ABI7500 PCR 仪(Applied Biosystems USA)。1.1.2样本来源样本来源于本院收治的1例女性COVID-19确诊患者,该患者住院时间是2 0 2 0 年2月17 日至3月5日,人院前鼻塞、流沸、咽痛8天,咳嗽7 天,发热3天,新型冠状病毒核酸检测结果阳性,胸部CT平扫结果提示左肺上叶少许炎症。在此病人住院治疗期间,感
14、染科医生为了监测治疗效果,在病人签署知情同意书的情况下,每天采集一个鼻咽拭子到我们实验室进行新型冠状病毒核酸检测,采集后的样本立即保存在灭活病毒保存管中,4保存及时送检。将此病人入院后治疗的前6 d设为治疗初期,这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为1、2、3、4、5、6,设为A组。在出院前一周的治疗设为治疗后期,这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为7、8、9、10、11、12,设为B组。1.2方法1.2.1加样提取操作实验人员严格按照国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)的通知及新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)相关文件进行实验操作和生物安全防护。
15、取出含提取试剂9 6 孔的深孔板平衡至室温,小心撕开铝膜,样本孔位依次加入15uL的Pro-teinase K。将A组和B组的12 个3mL的样本充分混匀后,每个样本以每管2 0 0 uL的液量分装到四个不同的1.5mLEP管中。实验的步骤如下:实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine,A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4文中将以0 min、5mi n、15mi n、30 mi n 表示不同的静置时间。1.2.2核酸扩增使用PCR仪,根据核酸检测试剂盒说明书设置反应程序,利用一步法反转录-聚合酶链反
16、应(RT-PCR)技术,选取SARS-CoV-2病毒的ORF1ab和N基因作为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针用于SARS-CoV-2检测。试剂盒同时包括了内源性内标系统,用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控。1.2.3PCR反应条件50 的初始反转录15min,紧随9 5变性步骤15 min,随后进行 45次9 4循环15s,55 45s,最后一步40 2 0 s。1.2.4结果判定阴性结果:N基因和ORF1ab基因无典型S型扩增曲线或Ct40,且Cy5通道有明显扩增曲线;阳性结果:(N基因和ORFlab基因Ct40,且有典型的S型扩增曲线。如果N基因或ORF1ab基因Ct
17、40,)复检后结果一致可判为阳性。要求阴性质控和阳性质控均在控。1.2.5统计学方法比较扩增后A组N基因和ORFlab基因Ct,Pearson积矩相关分析不同标本之间的 CT系数,graphpad5.0对图形进行了说明,MedCalc软件绘制Bland-Altman曲线,并对CT进行一致性分析,P0.05为差异有统计学意义。因B组部分样本N基因和ORF1ab基因结果出现假阴性结果,没有Ct,只能用excel2016比较阳性率。本研究采用统计分析软件spss19.0。2结果2.1治疗初期A组提取核酸前不同静置时间处理的Ct:见表1。2.2相关分析治疗初期A组的6 个样本0 min与5min、15
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