PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药.pdf

现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期回论著【Original Article基础研究?【Ba s i c Re s e a r c h MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.213901PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药焦海晶”，李珍2 3，黄少冰2 3，韩强3，荣雪竹2 3，,刘洋2.3中国医科大学附属第四医院检验科,辽宁沈阳110 0 0 1；中国医科大学基础医学院病理学教研室，辽宁沈阳110 0 0 1;3中国医科大学附属第一医院病理科，辽宁沈阳110 0 0 1【摘要】目的：探讨p21激活激酶3(PAK3）在介导非小细胞肺癌（nons ma l l c e l l l u n g c a n c e r,NSCLC)对吉非替尼耐药过程中的作用和分子机制。方法：我们通过免疫组化方法检测了肺腺癌患者在出现吉非替尼耐药前后PAK3的表达模式,并通过WesternBlot检测了PAK3在肺癌细胞系HCC827和PC9吉非替尼耐药前后的表达模式。应用PAK3-siRNA下调肺癌细胞系中PAK3的表达后,通过Western Blot和细胞功能学实验,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及ERK1 的活性变化。抑制ERKI 的活性后,转染PAK3-cDNA质粒,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及其对吉非替尼的敏感性变化。结果：PAK3在肺癌组织和细胞系对吉非替尼耐药后出现显著增强;在肺癌细胞系中,PAK3能够促进肺癌细胞增殖、侵袭能力及相关蛋白的表达,激活ERK1 的活性,并减弱肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性。抑制 ERK1 的活性后,PAK3的表达上调对肺癌细胞恶性表型的促进作用,及其对吉非替尼耐药的促进作用显著减弱。结论:PAK3通过激活ERK1促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力,进而促进NSCLC对吉非替尼耐药。【关键词】非小细胞肺癌；吉非替尼耐药;PAK3;ERK1【中图分类号】R734.2【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 1-390 1-0 7PAK3 mediates Gefitinib resistance to non-small cell lung cancer by activating ERK1activityJIAO Hajing,L Zhen,HUANG Shaobing,HAN Qiang,RONG Xuezhu,LU Yango2,3Department of Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China;2 Department of Pathology,Basic Medical Collegel of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China;Department of Pa-thology,the First Hospital of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e a n d mo l e c u l a r me c h a n i s m o f p 2 1 a c t i v a t e d k i n a s e 3(PA K 3)i n t h eGefitinib resistance in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods:Using immunohistochemical methods,wecompared the expression patterns of PAK3 in lung adenocarcinoma patients before and after Gefitinib resistance.UsingWestern Blot,we compared PAK3 expressionin lung cancer cell lines HCC827 and PC9 before and after Gefitinib re-sistance.After downregulating PAK3 in lung cancer cells using PAK3-siRNA,we detected the proliferation,inva-sion,and ERK1 activity by Western Blot and cellular functional experiments.After inhibiting the activity of ERK1,thePAK3-cDNA plasmid was transfected to detect the proliferation,invasion,and the sensitivity to Gefitinib.Results:PAK3 expression showed significantly increased in the lung cancer tissues and cell lines after Gefitinib resistance.PAK3 promoted the cell proliferation,invasion,and the related proteins expression in lung cancer cells.PAK3 activa-ted the activity of ERK1 and reduced the sensitivity of lung cancer cell lines to Gefitinib.After inhibiting the activityof ERK1,upregulated PAK3 expression didnt significantly promote the cell malignant phenotype and its Gefitinib re-sistance.Conclusion:PAK3 promotes the proliferation and invasion ability of lung cancer cells by activating ERKl,then promotes NSCLC resistance to Gefitinib.【收稿日期】2023 05 05【基金项目】国家自然科学基金项目（编号：8 2 0 0 3119）【作者简介】焦海晶（198 3一），女，辽宁沈阳人，硕士，主管技师，主要从事肺癌相关临床检验工作及治疗耐药相关机制研究。E-mail：【通信作者】文刘洋（197 9一），女，辽宁沈阳人，博士，主任医师，教授,硕士生导师，主要从事肺癌发生发展及分子靶向治疗相关研究。E一mail:liuyanglovebee 【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 3-0 6-2 5D0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.21.0013902Key words non-small cell lung cancer,Gefitinib resistance,PAK3,ERK1近几年，随着分子靶向治疗的飞速发展，我们沿袭多年的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC)传统治疗模式正在被逐渐改变。目前，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase in-hibitors,EGFR-TKIs）的应用，已逐步成为具有EGFR敏感突变的 NSCLC 患者,特别是晚期患者不可或缺的治疗策略之二1-3。虽然 ECFR-TKIs 的疗效显著,但其用药过程中难以避免的耐药问题却成为其在临床应用中呕待解决的关键问题之一4-5。因此，寻找有效克服肺癌细胞ECFR-TKIs耐药的策略,克服耐药的发生,对延长患者的生存时间,提高患者的生存质量具有重要的意义。p21 激活激酶（p21activated kinases,PAKs）是进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAKs作为RhoGTP酶家族成员Cdc42/Racl的下游效应因子，它们通过磷酸化下游底物,其广泛存在下游结合蛋白或激酶底物，在人类多种恶性肿瘤的进程中发挥了重要作用。PAKs可分为 GroupI（包括PAK1、PA K 2 和PAK3）和 GroupI（包括PAK4、PA K 5和PAK6)两大类，他们在组织分布及结构功能等方面具有显著的差异性6-7 。我们曾经证实到 PAKs在肺癌组织和细胞系中存在过表达8 。在本研究中,我们拟进一步明确其家族成员中,PAK3对肺癌细胞恶性表型的影响,并分析患者在接受一代EGFR-TKIs(吉非替尼)治疗耐药前后 PAK3的表达模式,探讨PAK3的异常表达在介导肺癌细胞对吉非替尼产生获得性耐药的过程中是否发挥作用,为寻求克服肺癌细胞吉非替尼耐药的治疗策略提供参考。1材料与方法1.1 患者样本收集2 0 16 年至2 0 2 1年在中国医科大学附属第一医院和中国医科大学附属第四医院行EGFR分子检测的外科手术切除或组织学活检的原发性肺腺癌患者标本58 7 例,所有患者术前均未接受放化疗、靶向治疗及免疫治疗。其中具有EGFR突变的肺癌患者2 7 9例（47.53%），包括：EGFR基因19DEL突变113例（40.50%），ECFR基因2 1L858R突变127例（45.52%）,L861Q突变3例（1.0 8%）,ECFR基因18G719突变2 2 例（7.8 9%）,EGFR基因2 0 insertion突变14例（5.0 2%）。我们随访了其中在分子检测后只接受吉非替尼靶向治疗的患者2 0 1 例,其中有116 例患者（19 DEL突变55例,2 1L858R突变6 1例)在出现吉非替尼耐药后接受了二次组织学活检。二次活检部位包括：肺内原发病灶32 例，淋巴结转移病灶2 8 例,骨转移病灶2 0 例,肺内转移灶15例,脑转移病灶12 例,肝转移病灶9 例。标本均经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。1.2免疫组织化学染色及结果判读切片(4微米)在二甲苯中脱蜡,梯度酒精水化以及柠檬酸修复液中进行高温高压抗原修复2 分钟。采用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性并采用正常山羊血清孵育以减少非特异性结合位点。一抗使用免单克隆抗体PAK3EP797Y抗体（1:2 0 0 ab40808，A b c a m，美国），4孵育过夜。生物素标记的二抗（Ultrasensitive；M a i Xi n，福州，中国）37孵育30 分钟,DAB显色。苏木素复染，脱水,封片。焦海晶，等PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药Modern Oncology 2023,31(21):3901-3907每张切片随机选择5个视野，每个视野计数10 0 个细胞。根据计数细胞的胞浆着色百分比及胞浆着色的强度对PAK3的表达评分。根据细胞着色百分比分为1(1%25%)、2(2 6%50%)、3(51%7 5%)和4(7 6%10 0%)四个等级，根据细胞着色的强度分为0（无着色）、1（浅黄色颗粒）、2(深黄色或者棕褐色颗粒)三个等级。将每张切片的着色百分比和着色分数相乘,所得的乘积（0 8 分)为该切片的最终得分，胞浆着色得分大于3分为阳性表达（过表达）。1.3细胞培养及转染人类肺腺癌细胞系HCC827（EG FR19D EL）,PC9（EG FR19DEL)培养于含10%灭活胎牛血清，2.3g/LNaHCO3，100units/mL青链霉素的RPMI1640（I n v i t r o g e n，美国）培养液中，于37,5%C0，饱和湿度条件下的培养箱中培养。我们采用吉非替尼浓度梯度递增法联合高浓度吉非替尼间断冲击法,建立吉非替尼耐药细胞系HCC827-GR 和PC9-GR,并以 CCK-8 实验测定 ICso鉴定细胞系9。将细胞系于6 孔板中培养2 4小时后，根据说明书使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,California）进行转染。PAK3-cDNA、PA K 3一siRNA及其阴性对照质粒均购自于通用生物（General biol,安徽,中国）。48 小时后提取蛋白,并以WesternBlot鉴定转染效果。1.4Western Blot采用细胞裂解液（Pierce,Rockford,IL,USA）对细胞进行充分裂解，然后分别提取其总蛋白，取40 微克的总蛋白通过12%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳，然后转印到PVDF膜（Millipore,Bedford,MA,USA）上。1%脱脂奶粉封闭2 小时，一抗分别采用PAK3（1:10 0 0 0,A b c a m，美国）,CyclinD1(sc-8396,1:200,Santa Cruz Biotechnology,CA,美国),CyclinE(sc-377100,1:200,Santa Cruz Biotechnology),MMP2(sc-13595,1:300,Santa Cruz,美国）,MMP9(sc-393859,1:300,Santa Cruz,美国）,ERK1（a b 119357,1：50 0,A b c a m，美国），phospho-ERK1（a b 1947 7 6,1:50 0,A b c a m,美国）,GAPDH（517 4,1:10 0 0 0,C ST,D a n v e r s,M A,美国）4过夜。山羊抗鼠/兔二抗(1:2 0 0 0,Santa Cruz Biotechnology,Inc.CA,USA)37孵育2 小时。ECL发光后,Bio-Image system(EpiChemiI D a r k r o o m,U V P)进行条带灰度值测定，与GAPDH的比值作为相对表达量。1.5CCK-8实验我们采用CCK-8试剂盒（GlpBioTechnology，M o n t c l a i r,CA,USA)分析肺癌细胞系的增殖能力。在9 6 孔板中用含10%血清的培养基培养细胞系（约10 0 0 个/10 0 微升),分别应用不同浓度吉非替尼处理各组细胞系后，每孔加入10 微升CCK-8试剂2 小时后,应用酶标仪（Bio-Rad Laborato-ries,Hercules,CA,USA)检测450 nm波长的吸收峰值。1.6细胞克隆形成实验在6 孔细胞培养板中,按照每个孔50 0 个细胞计算细胞悬液体积再加入4mL培养基,混匀铺入6 孔板内摇匀,放在37孵箱中培养10 14天,在显微镜下观察细胞集落形成。集落形成后用结晶紫染色，吸出六孔板中的培养基,PBS洗3现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期次,从冰箱取出冰甲醇每孔加入1mL固定细胞集落15min，固定完毕后用PBS洗3次，结晶紫染液染色10 min。最后用photoshop软件截取相同面积的细胞集落图,计数细胞形成的集落数。1.7Transwell侵袭实验按照BD公司说明操作，上室内加人10 0 L以无血清RPMI1640稀释的人工基底膜胶（BDBiosciences）,37，5%COz条件下放置2 小时。用无血清的RPMI1640培养液将细胞浓度调整至510 个/mL,取10 0 L细胞悬液滴入上室内，下室加入含有2 0%胎牛血清的RPMI1640培养液600L,上下室之间用孔径为8 m的聚碳酸酯微孔滤膜（Co r m i n g，美国）分开，将小室置37,5%CO2条件下分别放置2 4h后,弃去上室内液体，擦尽膜上Matrigel,100%甲醇固定30 分钟，常规苏木素染色，室温干燥过夜,取下聚碳酸酯微孔膜，置载玻片上，光镜下计细胞数。1.8ERK1信号通路抑制剂将细胞接种在6 孔组织培养板中,待其过夜贴壁后。CC-90003（10 mol/L,ab287043,abcam，美国）溶解在二甲基亚砜(（DMSO,Invitrogen,美国)中。以DMSO为对照,48 小时后收集细胞用于后续实验分析。1.9统计学分析所有数据采用 SPSS(version 24.0;IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析。采用检验来分析PAK3表达与患者吉非替尼疗效之间的相关性。细胞系实验结果均重复三次后，取均值，以平均数土标准差表示。采用t检验分析。P59GenderMaleFemaleDifferentiationWell-ModeratePoorT stageT,-T2T,-T4TNM stageI-III-IV2.2下调PAK3的表达显著抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力分别向HCC827/CR和PC9/CR细胞系中导入PAK3-siRNA及其对照质粒以WesternBlot验证转染效率后（图2A）,通过细胞功能学实验检测肺癌细胞系的增殖和侵袭能力。克隆形成实验（图2 B）和Transwell实验结果（图2 C）显示，下调PAK3的表达后，肺癌细胞系的克隆形成能力和侵袭能力明显减弱。同时,通过Western Blot方法,我们也进一步证实到下调PAK3的表达后,肺癌细胞系的金属蛋白酶MMP2和MMP9,以及细胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表达均出现明显下调（图2 D）。2.3PAK3促进ERK1的活性以及肺癌细胞对吉非替尼耐药我们在肺癌细胞系耐药前后检测了ERK1 的表达,结果显示,与HCC827和PC9细胞系相比,HCC827/CR和PC9/GR细胞系中ERK1的表达显著增强（图3A）。我们向HCC827/GR和PC9/GR细胞系中分别导人PAK3-siRNA（图3B）,向HCC827和PC9细胞系中分别导人PAK3-cDNASecondary biopsy histologicalnsection score12333903PAK3TotalPositive(n=116)(n=67)5131653648276840663250356330533755246143质粒（图3C），我们还证实到PAK3的表达下调能够明显抑制ERK1的磷酸化水平。而在HCC827和PC9细胞系中，5PAK3的表达上调能够显著促进ERK1的磷酸化。同时,通382212Negative.(n=49)0.55920292128341533163118过 CCK-8实验,检测了PAK3表达改变后,肺癌细胞在不同浓度吉非替尼处理后的增殖能力（图3D）。结果显示PAK3表达下调的HCC827/GR和PC9/GR细胞系对吉非替尼的敏感性显著增强；而上调PAK3的表达后,HCC827和PC9对吉非替尼的敏感性显著减弱。P0.7820.0200.0160.003:3904:焦海晶，等B6PAK3GAPDHPAK3通过激活ERK1 活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药HCC827 HCC827/GR1.0-0.8-65kD0.60.436kD0.20HCC827HCC827/GR*1.0-PC9PAK3GAPDH图1PAK3在肺腺癌中对吉非替尼耐药后的表达显著增强A:免疫组化结果显示,部分肺腺癌患者在吉非替尼耐药后PAK3的表达显著增强。初次肺内原发肺腺癌病灶组织学切片中PAK3表达评分为2 分（a:IHC200;b:IHC400）,在其对吉非替尼耐药后的肺内转移灶二次活检组织学切片中，其PAK3的表达评分为8 分（c:IHC200;d:IHC400）。B：W e s t e r n Blo t 方法检测PAK3在HCC827和PC9及其耐药细胞系中的蛋白表达，及其统计分析（n=3，*P0.001)。A:Immunohistochemical results showed that the expression of PAK3 was significantly increased in some lung adenocarcinoma patients with Gefitinib re-sistance.It showed PAK3 expression with 2 points in a patients first histological section(a-b)(a:IHC 200;b:IHC 400),and his secondary bi-opsy section with Geftinib resistance got 8 points(c-d)(c:IHC x200;d:IHC400).B:Westen Blot was used to detect the protein expression ofPAK3 in HCC827,PC9,and their Gefitinib-resistant cell lines.Their statistical analysis was also performed(n=3,*P0.001).PCP/GRAHCC827/GRSi-NCsi-PAK3PAK3GAPDHPC9/GRSi-NC Si-PAK3PAK3GAPDHBHCC827/GRsi-NCSi-PAK3PC9/GRSi-NCSi-PAK3HCC827/GRCSi-NCPC9/GRSi-NCPAKPC9/GR65 kD36kDFig.1 Lung adenocarcinomas with Gefitinib resistance showed enhanced expression of PAK3DHCC827/GRPC9/GR65kD1.2-36kD1.00.80.60.4-0.265kD0-36kD300-200-15010050-0Si-NC600Si-PAK3500-400300-200-100-00.80.60.40.20HCC827/GRSi-NCsi-PAK3Si-NC si-PAK3MMP21.2-1.0-0.80.60.4*0.20si-NCSi-PAK3HCC827/GRSi-PAK3HCC827/GR*si-NCSi-PAK3*PC9PC9/GR72kDMMP992kDCyclinD136kD*CyclinEsi-NCSi-PAK3300-PC9/GR62502001500100500si-NC600PC9/GR500-400300-.60200N1000Si-NC47kDGAPDH36kDHCC827/GR1.0.si-NC0.8si-PAK30.60.4*0.2-0.0Si-PAK3MMP21.21.00.80.60.40.20.0si-PAK3MMP2MMP9*工PC9/GR*工CyelinE.si-NCsi-PAK3*CyelinE*图2 PAK3的表达下调抑制肺癌细胞的增殖和侵袭A:Western Blot结果验证PAK3-siRNA在 HCC827/GR和PC9/GR细胞系中的干扰效率;B:克隆形成实验结果及统计分析结果;C:Transwell实验结果及统计分析结果（结晶紫染色2 0 0);D:Western Blot结果显示,PAK3的表达下调能够显著抑制耐药细胞系中MMP2、M M P9、Cy-clinD1、Cy c li n E 的表达(n=3,*P0.05,*P0.01,*P0.001)。Fig.2Downregulated PAK3 inhibits the cell proliferation and invasion in lung cancer cellsA:Western Blot results verified the interference efficiency of PAK3-siRNA in HCC827/GR and PC9/GR cell lines.B:Clone formation results and sta-tistical analysis results.C:Transwell results and statistical analysis results(crystal violet staining x 200).D:Western Blot results showed that PAK3downregulation significantly inhibited the expression of MMP2,MMP9,CyclinD1,and CyclinE in Gefitinib-resistant cell lines(n=3,*P0.05,*P0.01,*P0.001).现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期AHCC827HCC827/GRPC9PC9/GRp-ERK144kDGAPDH36kDBCsi-NCSi-PAFp-ERK144kDGAPDH36kDHCC827/GRPC9/GRCK3-PAK-PAp-ERK144kDGAPDH36kDHCC827PC9DHCC8271.5-1.0-0.5-+p-EV*p-PAK30.00.0010.01.0.110Gefitinib(mol/L)A：W e s t e r m Blo t 检测HCC827、PC9、H CC8 2 7/CR、PC9/G R细胞系中磷酸化的ERK1的表达;B:向HCC827/GR和PC9/GR细胞系中分别导入PAK3-siRNA,Western Blot检测磷酸化的ERK1的表达;C:向HCC827和PC9细胞系中分别导入PAK3-cDNA质粒,Western Blot检测磷酸化的ERK1的表达;D:分别上调和下调PAK3的表达后，CCK-8实验检测肺癌细胞在不同浓度吉非替尼处理后的增殖能力（n=3，*P0.05,*P0.01,*P0.001)。Fig.3 PAK3 promoted the phosphorylation of ERK1 and the resistance of lung cancer cells to GefitinibA:Western Blot was used to detect the expression of phosphorylated ERK1 in HCC827,PC9 and their Gefitinib-resistant cell lines.B:PAK3-siRNAwas introduced into HCC827/GR and PC9/GR cell lines respectively,and the expression of phosphorylated ERK1 was detected by Western Blot.C:PAK3-cDNA was introduced into HCC827 and PC9 cell lines,and Western Blot was used to detect the phosphorylated ERK1.D:Affer regulatingthe expression of PAK3,the CCK-8 experiment was used to detect the sensitivity of lung cancer cell lines to different concentrations of Gefitinib(n=3,*P0.05,*P0.01,*P0.001).2.4PAK3通过激活ERK1活性促进肺癌细胞系的增殖和侵袭，并减弱肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性HCC827和PC9细胞系中,PAK3的表达上调能够促进MMP2、M M P9、Cy c l i n D 1和CyclinE的表达（图4A）。而应用ERK抑制剂CC-90003抑制HCC827和PC9细胞系中ERK1的活性后，再导人PAK3的cDNA质粒，通过WesternBlot方法发现,抑制ERK1的活性后,PAK3的表达上调并不能显著促进肺癌细胞系中MMP2、M M P9、Cy c l i n D 1和CyclinE的表达(图4B）。同时,应用CCK-8方法还发现,与对照组相比,在HCC827和PC9细胞系中,抑制ERK1的活性后，上调PAK3表达的肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性并没有出现显著减弱(图4C)。3讨论NSCLC 患者对EGFR-TKI耐药是一个多因素、多步骤的过程10-1。揭示其中可能的耐药分子机制,能够为 ECFR-TKI 耐药性 NSCLC 的新治疗策略提供理论基础和科学依据。近年来，尽管PAKs家族成员成为药物研发的重要靶点，但是PAK3在肺癌中表达的意义,及其在介导EGFR-TKI 耐药过程中是否发挥作用，目前鲜有相关报道。MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.211.00.80.6.0.40.20+HCC827HCC827/GR1.00.80.6.0.4O0.20+si-NC1.070.80.6.0.40.20十p-EVPC92.0-1.51.0-*0.5+p-EV*P-PAK30.00.010.01.0.110Gefitinib(mol/L)图3PAK3促进ERK1 的活性以及肺癌细胞对吉非替尼的耐药性3905.1.0*0.80.6.0.40.20+PC91.00.80.6.0.4*0.20+Si-PAK3si-NC*1.070.80.6.0.40.2-0+p-PAK3P-EVHCC827/GR1.51.0-0.5*+Si-NC+Si-PAK30.00.001 0.01.0.1110Gefitinib(mol/L)在本研究中，我们首先对比分析了吉非替尼耐药前后，PAK3在肺腺癌患者组织学切片和肺腺癌细胞系中的表达情况。结果显示，PAK3在出现吉非替尼耐药后表达明显增强。这提示我们,PAK3的过表达在促进NSCLC对吉非替尼耐药过程中可能发挥了重要作用。下调肺癌细胞系中PAK3的表达后,肺癌细胞的增殖和侵袭能力,以及调控增殖和侵袭能力相关蛋白（CyclinD1、Cy c l i n E、M M P2、M M P9）的表达，均出现显著减弱。我们已知，细胞周期的关键是G，期的启动，CyclinD1作为调控细胞周期G期的关键蛋白，对细胞周期的调控至关重要。它通过结合并激活G期的周期蛋白依赖性激酶CDK4,从而推动周期由G,进人S期12-14。而CyclinE主要通过结合并激活CDK2,成为细胞周期G,/S期的转折中的关键调控因子。CyclinD1和 CyclinE的过度表达可导致 G,/S期调控点的失衡,最终导致肿瘤细胞的增殖失控，促进恶性肿瘤的发生15-1。因此,PAK3 促进细胞周期蛋白的表达后,肺癌细胞的增殖能力会出现明显增强。MMP2和MMP9作为基质金属蛋白酶的重要成员，能够降解细胞外基质中的多种蛋白质底物，在促进细胞增殖、迁移和分化过程中发挥PC9/GR士*si-PAK3*p-PAK3PC9/GR2.01.5-*1.00.5+Si-NC+Si-PAK30.00.001.0.01.0.1110Gefitinib(mol/L)*13906着重要作用18-2 0 。因此,PAK3 通过调节细胞周期蛋白（Cy c l i n D 1、Cy c l i n E）和基质金属蛋白酶（MMP2、M M P9）的表达，调控肺癌细胞的增殖和侵袭能力。而细胞增殖和侵袭能力的增强在促进肺癌细胞对 EGFR-TKI 耐药的过程中起到AP-PAK3PAK3MMP2MMP9CyclinD1CyclinEGAPDHHCC827CC-90003CC-90003焦海晶，等HCC82765kD1.272kD*1.0工92kD0.80.636kD0.447kD0.236kD0.0+PC9PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药了至关重要的作用。同时，我们在肺癌细胞系中也证实到PAK3表达下调的HCC827/GR和PC9/GR细胞系对吉非替尼的敏感性显著增强；而上调PAK3的表达后,HCC827和PC9对吉非替尼的敏感性显著减弱。op-EVOp-PAK3*工MMP2PC91.0-*0.8*0.61.0.40.2HE0.0+PAK3MMP2CyclinEOP-EVDP-PAK3*工*工*工BPAK3MMP2MMP9CyclinD1CyclinEp-ERK1GAPDHHCC827C1.0-0.5-p-EV+p-PAK30.00.001A：在HCC827和PC9细胞系中，应用Western Blot验证PAK3的转染效率后,检测PAK3的表达上调对MMP2、M M P9、Cy c l i n D 1、Cy c l i n E的表达调控;B：应用ERK1抑制剂CC-90003抑制HCC827和PC9细胞系中ERK1的活性后，再导入PAK3的cDNA质粒，通过WesternBlot检测PAK3的表达上调对MMP2、M M P9、Cy c l i n D 1、Cy c l i n E的表达调控;C:CC-90003处理HCC827和PC9细胞系后，上调PAK3的表达，应用CCK-8检测肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性(n=3，*P 0.0 5,*P 0.0 1,*P 0.0 5)。A:Western Blot results verified the transfection efficiency of PAK3 in HCC827 and PC9 cell lines.Upregulated PAK3 expression significantly enhancedthe expression of MMP2,MMP9,CyclinD1 and CyclinE.B:In HCC827 and PC9 cell lines with ERK1 inhibitor CC-90003,Western Blot showed thatupregulated PAK3 showed not significantly promotion on MMP2,MMP9,CyclinD1 and CyclinE.C:In HCC827 and PC9 cell lines with CC-90003 andPAK3-cDNA,the sensitiveness to Gefitinib was detected by CCK-8(n=3,*P0.05,*P0.01,*P0.05).我们拟进一步明确在非小细胞肺癌中，介导PAK3促进肺癌细胞恶性表型的信号通路。已有大量研究证实,RAS-ERK是EGFR下游主要的信号通路之一,可通过一系列蛋白的级联磷酸化，激活ERK,进而调控多种转录因子的表达，促进细胞的增殖、侵袭和转移能力2 1-2 3。其异常激活是导致肺癌细胞出现 EGFR-TKI 耐药的主要机制之一2 4-2 5。因此,我们检测了肺癌细胞系中ERK1 的表达情况。我们发现,ERK1在肺癌细胞出现吉非替尼耐药后,出现明显的表达增强;PAK3能够显著激活ERK1的磷酸化,且应用ERK1活性抑制剂抑制ERK1的活性后,PAK3的过表达不能显著促进肺癌细胞系中CyclinD1、Cy c l i n E、M M P2、M M P9的蛋白表达，以及肺癌细胞系对吉非替尼的耐药性。那么，在肺癌细AK3-PAPC9Fig.4PAK3 promotes the lung cancer cells proliferation and invasion through phosphorylated ERK1AK3Vd-d65kD72kD92kD36kD47kD44kD36kDHCC827+CC-9000