PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药.pdf
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1、现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期回论著【Original Article基础研究?【Ba s i c Re s e a r c h MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.213901PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药焦海晶”,李珍2 3,黄少冰2 3,韩强3,荣雪竹2 3,,刘洋2.3中国医科大学附属第四医院检验科,辽宁沈阳110 0 0 1;中国医科大学基础医学院病理学教研室,辽宁沈阳110 0 0 1;3中国医科大学附属第一医院病理科,辽宁沈阳110 0 0 1【摘要】目的:探讨p21激活激酶3(PAK3)在介导非
2、小细胞肺癌(nons ma l l c e l l l u n g c a n c e r,NSCLC)对吉非替尼耐药过程中的作用和分子机制。方法:我们通过免疫组化方法检测了肺腺癌患者在出现吉非替尼耐药前后PAK3的表达模式,并通过WesternBlot检测了PAK3在肺癌细胞系HCC827和PC9吉非替尼耐药前后的表达模式。应用PAK3-siRNA下调肺癌细胞系中PAK3的表达后,通过Western Blot和细胞功能学实验,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及ERK1 的活性变化。抑制ERKI 的活性后,转染PAK3-cDNA质粒,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及其对吉非替尼的敏感性变化。结果
3、:PAK3在肺癌组织和细胞系对吉非替尼耐药后出现显著增强;在肺癌细胞系中,PAK3能够促进肺癌细胞增殖、侵袭能力及相关蛋白的表达,激活ERK1 的活性,并减弱肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性。抑制 ERK1 的活性后,PAK3的表达上调对肺癌细胞恶性表型的促进作用,及其对吉非替尼耐药的促进作用显著减弱。结论:PAK3通过激活ERK1促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力,进而促进NSCLC对吉非替尼耐药。【关键词】非小细胞肺癌;吉非替尼耐药;PAK3;ERK1【中图分类号】R734.2【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 1-390 1-0 7PAK3 mediates Gefitini
4、b resistance to non-small cell lung cancer by activating ERK1activityJIAO Hajing,L Zhen,HUANG Shaobing,HAN Qiang,RONG Xuezhu,LU Yango2,3Department of Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China;2 Department of Pathology,Basic Medical
5、Collegel of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China;Department of Pa-thology,the First Hospital of China Medical University,Liaoning Shenyang 110001,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e a n d mo l e c u l a r me c h a n i s m o f p 2 1 a c t i v a
6、t e d k i n a s e 3(PA K 3)i n t h eGefitinib resistance in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods:Using immunohistochemical methods,wecompared the expression patterns of PAK3 in lung adenocarcinoma patients before and after Gefitinib resistance.UsingWestern Blot,we compared PAK3 expressionin lun
7、g cancer cell lines HCC827 and PC9 before and after Gefitinib re-sistance.After downregulating PAK3 in lung cancer cells using PAK3-siRNA,we detected the proliferation,inva-sion,and ERK1 activity by Western Blot and cellular functional experiments.After inhibiting the activity of ERK1,thePAK3-cDNA p
8、lasmid was transfected to detect the proliferation,invasion,and the sensitivity to Gefitinib.Results:PAK3 expression showed significantly increased in the lung cancer tissues and cell lines after Gefitinib resistance.PAK3 promoted the cell proliferation,invasion,and the related proteins expression i
9、n lung cancer cells.PAK3 activa-ted the activity of ERK1 and reduced the sensitivity of lung cancer cell lines to Gefitinib.After inhibiting the activityof ERK1,upregulated PAK3 expression didnt significantly promote the cell malignant phenotype and its Gefitinib re-sistance.Conclusion:PAK3 promotes
10、 the proliferation and invasion ability of lung cancer cells by activating ERKl,then promotes NSCLC resistance to Gefitinib.【收稿日期】2023 05 05【基金项目】国家自然科学基金项目(编号:8 2 0 0 3119)【作者简介】焦海晶(198 3一),女,辽宁沈阳人,硕士,主管技师,主要从事肺癌相关临床检验工作及治疗耐药相关机制研究。E-mail:【通信作者】文刘洋(197 9一),女,辽宁沈阳人,博士,主任医师,教授,硕士生导师,主要从事肺癌发生发展及分子靶向治疗
11、相关研究。E一mail:liuyanglovebee 【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 3-0 6-2 5D0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.21.0013902Key words non-small cell lung cancer,Gefitinib resistance,PAK3,ERK1近几年,随着分子靶向治疗的飞速发展,我们沿袭多年的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)传统治疗模式正在被逐渐改变。目前,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-t
12、yrosine kinase in-hibitors,EGFR-TKIs)的应用,已逐步成为具有EGFR敏感突变的 NSCLC 患者,特别是晚期患者不可或缺的治疗策略之二1-3。虽然 ECFR-TKIs 的疗效显著,但其用药过程中难以避免的耐药问题却成为其在临床应用中呕待解决的关键问题之一4-5。因此,寻找有效克服肺癌细胞ECFR-TKIs耐药的策略,克服耐药的发生,对延长患者的生存时间,提高患者的生存质量具有重要的意义。p21 激活激酶(p21activated kinases,PAKs)是进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAKs作为RhoGTP酶家族成员Cdc42/Racl的下游效
13、应因子,它们通过磷酸化下游底物,其广泛存在下游结合蛋白或激酶底物,在人类多种恶性肿瘤的进程中发挥了重要作用。PAKs可分为 GroupI(包括PAK1、PA K 2 和PAK3)和 GroupI(包括PAK4、PA K 5和PAK6)两大类,他们在组织分布及结构功能等方面具有显著的差异性6-7 。我们曾经证实到 PAKs在肺癌组织和细胞系中存在过表达8 。在本研究中,我们拟进一步明确其家族成员中,PAK3对肺癌细胞恶性表型的影响,并分析患者在接受一代EGFR-TKIs(吉非替尼)治疗耐药前后 PAK3的表达模式,探讨PAK3的异常表达在介导肺癌细胞对吉非替尼产生获得性耐药的过程中是否发挥作用,
14、为寻求克服肺癌细胞吉非替尼耐药的治疗策略提供参考。1材料与方法1.1 患者样本收集2 0 16 年至2 0 2 1年在中国医科大学附属第一医院和中国医科大学附属第四医院行EGFR分子检测的外科手术切除或组织学活检的原发性肺腺癌患者标本58 7 例,所有患者术前均未接受放化疗、靶向治疗及免疫治疗。其中具有EGFR突变的肺癌患者2 7 9例(47.53%),包括:EGFR基因19DEL突变113例(40.50%),ECFR基因2 1L858R突变127例(45.52%),L861Q突变3例(1.0 8%),ECFR基因18G719突变2 2 例(7.8 9%),EGFR基因2 0 insertio
15、n突变14例(5.0 2%)。我们随访了其中在分子检测后只接受吉非替尼靶向治疗的患者2 0 1 例,其中有116 例患者(19 DEL突变55例,2 1L858R突变6 1例)在出现吉非替尼耐药后接受了二次组织学活检。二次活检部位包括:肺内原发病灶32 例,淋巴结转移病灶2 8 例,骨转移病灶2 0 例,肺内转移灶15例,脑转移病灶12 例,肝转移病灶9 例。标本均经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。1.2免疫组织化学染色及结果判读切片(4微米)在二甲苯中脱蜡,梯度酒精水化以及柠檬酸修复液中进行高温高压抗原修复2 分钟。采用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性并采用正常山羊血清孵
16、育以减少非特异性结合位点。一抗使用免单克隆抗体PAK3EP797Y抗体(1:2 0 0 ab40808,A b c a m,美国),4孵育过夜。生物素标记的二抗(Ultrasensitive;M a i Xi n,福州,中国)37孵育30 分钟,DAB显色。苏木素复染,脱水,封片。焦海晶,等PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药Modern Oncology 2023,31(21):3901-3907每张切片随机选择5个视野,每个视野计数10 0 个细胞。根据计数细胞的胞浆着色百分比及胞浆着色的强度对PAK3的表达评分。根据细胞着色百分比分为1(1%25%)、2(2 6%5
17、0%)、3(51%7 5%)和4(7 6%10 0%)四个等级,根据细胞着色的强度分为0(无着色)、1(浅黄色颗粒)、2(深黄色或者棕褐色颗粒)三个等级。将每张切片的着色百分比和着色分数相乘,所得的乘积(0 8 分)为该切片的最终得分,胞浆着色得分大于3分为阳性表达(过表达)。1.3细胞培养及转染人类肺腺癌细胞系HCC827(EG FR19D EL),PC9(EG FR19DEL)培养于含10%灭活胎牛血清,2.3g/LNaHCO3,100units/mL青链霉素的RPMI1640(I n v i t r o g e n,美国)培养液中,于37,5%C0,饱和湿度条件下的培养箱中培养。我们采用
18、吉非替尼浓度梯度递增法联合高浓度吉非替尼间断冲击法,建立吉非替尼耐药细胞系HCC827-GR 和PC9-GR,并以 CCK-8 实验测定 ICso鉴定细胞系9。将细胞系于6 孔板中培养2 4小时后,根据说明书使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,California)进行转染。PAK3-cDNA、PA K 3一siRNA及其阴性对照质粒均购自于通用生物(General biol,安徽,中国)。48 小时后提取蛋白,并以WesternBlot鉴定转染效果。1.4Western Blot采用细胞裂解液(Pierce,Rockford,IL,USA)对细胞
19、进行充分裂解,然后分别提取其总蛋白,取40 微克的总蛋白通过12%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳,然后转印到PVDF膜(Millipore,Bedford,MA,USA)上。1%脱脂奶粉封闭2 小时,一抗分别采用PAK3(1:10 0 0 0,A b c a m,美国),CyclinD1(sc-8396,1:200,Santa Cruz Biotechnology,CA,美国),CyclinE(sc-377100,1:200,Santa Cruz Biotechnology),MMP2(sc-13595,1:300,Santa Cruz,美国),MMP9(sc-393859,1:300,S
20、anta Cruz,美国),ERK1(a b 119357,1:50 0,A b c a m,美国),phospho-ERK1(a b 1947 7 6,1:50 0,A b c a m,美国),GAPDH(517 4,1:10 0 0 0,C ST,D a n v e r s,M A,美国)4过夜。山羊抗鼠/兔二抗(1:2 0 0 0,Santa Cruz Biotechnology,Inc.CA,USA)37孵育2 小时。ECL发光后,Bio-Image system(EpiChemiI D a r k r o o m,U V P)进行条带灰度值测定,与GAPDH的比值作为相对表达量。1.
21、5CCK-8实验我们采用CCK-8试剂盒(GlpBioTechnology,M o n t c l a i r,CA,USA)分析肺癌细胞系的增殖能力。在9 6 孔板中用含10%血清的培养基培养细胞系(约10 0 0 个/10 0 微升),分别应用不同浓度吉非替尼处理各组细胞系后,每孔加入10 微升CCK-8试剂2 小时后,应用酶标仪(Bio-Rad Laborato-ries,Hercules,CA,USA)检测450 nm波长的吸收峰值。1.6细胞克隆形成实验在6 孔细胞培养板中,按照每个孔50 0 个细胞计算细胞悬液体积再加入4mL培养基,混匀铺入6 孔板内摇匀,放在37孵箱中培养10
22、14天,在显微镜下观察细胞集落形成。集落形成后用结晶紫染色,吸出六孔板中的培养基,PBS洗3现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 1期次,从冰箱取出冰甲醇每孔加入1mL固定细胞集落15min,固定完毕后用PBS洗3次,结晶紫染液染色10 min。最后用photoshop软件截取相同面积的细胞集落图,计数细胞形成的集落数。1.7Transwell侵袭实验按照BD公司说明操作,上室内加人10 0 L以无血清RPMI1640稀释的人工基底膜胶(BDBiosciences),37,5%COz条件下放置2 小时。用无血清的RPMI1640培养液将细胞浓度调整至510 个/mL,取10 0 L细
23、胞悬液滴入上室内,下室加入含有2 0%胎牛血清的RPMI1640培养液600L,上下室之间用孔径为8 m的聚碳酸酯微孔滤膜(Co r m i n g,美国)分开,将小室置37,5%CO2条件下分别放置2 4h后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel,100%甲醇固定30 分钟,常规苏木素染色,室温干燥过夜,取下聚碳酸酯微孔膜,置载玻片上,光镜下计细胞数。1.8ERK1信号通路抑制剂将细胞接种在6 孔组织培养板中,待其过夜贴壁后。CC-90003(10 mol/L,ab287043,abcam,美国)溶解在二甲基亚砜((DMSO,Invitrogen,美国)中。以DMSO为对照,48 小时后
24、收集细胞用于后续实验分析。1.9统计学分析所有数据采用 SPSS(version 24.0;IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析。采用检验来分析PAK3表达与患者吉非替尼疗效之间的相关性。细胞系实验结果均重复三次后,取均值,以平均数土标准差表示。采用t检验分析。P59GenderMaleFemaleDifferentiationWell-ModeratePoorT stageT,-T2T,-T4TNM stageI-III-IV2.2下调PAK3的表达显著抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力分别向HCC827/CR和PC9/CR细胞系中导入PAK3-siRNA及其对照质粒以W
25、esternBlot验证转染效率后(图2A),通过细胞功能学实验检测肺癌细胞系的增殖和侵袭能力。克隆形成实验(图2 B)和Transwell实验结果(图2 C)显示,下调PAK3的表达后,肺癌细胞系的克隆形成能力和侵袭能力明显减弱。同时,通过Western Blot方法,我们也进一步证实到下调PAK3的表达后,肺癌细胞系的金属蛋白酶MMP2和MMP9,以及细胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表达均出现明显下调(图2 D)。2.3PAK3促进ERK1的活性以及肺癌细胞对吉非替尼耐药我们在肺癌细胞系耐药前后检测了ERK1 的表达,结果显示,与HCC827和PC9细胞系相比,HCC827/
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