HJ 347.1－2018 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法(环境保护).pdf

中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 347.12018 部分代替 HJ/T 3472007 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法 Water qualityDetermination of fecal coliformMembrane filtration 2018-12-26 发布 2019-06-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 347.12018 i 中华人民共和国生态环境部 公 告 2018 年 第 73 号 为贯彻中华人民共和国环境保护法 ，保护生态环境，保障人体健康，规范生态环境监测工作，现批准水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法等五项标准为国家环境保护标准，并予发布。 标准名称、编号如下。 一、 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法 （HJ 347.12018） ； 二、 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法 （HJ 347.22018） ； 三、 水质 细菌总数的测定 平皿计数法 （HJ 10002018） ； 四、 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 （HJ 10012018） ； 五、 水质 丁基黄原酸的测定 液相色谱- 三重四极杆串联质谱法 （HJ 10022018） 。 以上标准自 2019 年 6 月 1 日起实施，由中国环境出版集团出版，标准内容可在生态环境部网站（ 自以上标准实施之日起， 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行） （HJ/T 3472007）废止。 特此公告。 生态环境部 2018 年 12 月 26 日 HJ 347.12018 iii 目 次 前 言. iv 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 干扰和消除.1 6 试剂和材料.2 7 仪器和设备.2 8 样品.3 9 分析步骤.3 10 结果计算与表示.4 11 精密度和准确度.5 12 质量保证和质量控制.5 13 废物处理.6 14 注意事项.6 附录 A（资料性附录） 粪大肠菌群检验记录及报告格式.7 HJ 347.12018 iv 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法 ，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。 本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。 本标准是对水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行） （HJ/T 3472007）滤膜法部分的修订。 本标准首次发布于 2007 年，原起草单位为中国环境监测总站。本次为第一次修订。 本次修订的主要内容如下： 完善了方法原理的表述； 增加了检出限； 增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节； 自本标准实施之日起，水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法 （试行） （HJ/T 3472007）废止。 本标准的附录 A 为资料性附录。 本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。 本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。 本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。 本标准生态环境部 2018 年 12 月 26 日批准。 本标准自 2019 年 6 月 1 日起实施。 本标准由生态环境部解释。 HJ 347.12018 1 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法 1 适用范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的滤膜法。 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。 本方法的检出限：当接种量为 100 ml 时，检出限为 10 CFU/L；当接种量为 500 ml 时，检出限为2 CFU/L。 2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 494 水质 采样技术指导 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms） 。44.5培养 24 h，能在 MFC 选择性培养基上生长，发酵乳糖产酸，并形成蓝色或蓝绿色菌落的肠杆菌科细菌。 3.2 菌落形成单位 colony- forming units（CFU） 单位体积样品中的细菌群落总数。 4 方法原理 样品通过孔径为 0.45 m 的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于 MFC 选择性培养基上，在特定的温度（44.5）下培养 24 h，胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。 5 干扰和消除 5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.6）消除干扰。 5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）HJ 347.12018 2 时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7）消除干扰。 6 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。 6.1 MFC 培养基。 胰胨 10 g 蛋白胨 5 g 酵母浸膏 3 g 氯化钠 5 g 乳糖 12.5 g 胆盐三号 1.5 g 1%苯胺蓝水溶液 10 ml 1%玫瑰红酸溶液（溶于 8.0 g/L 氢氧化钠液中） 10 ml 将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰红酸外） ，溶解于 1 000 ml 水中，调节 pH 至 7.4，分装于三角烧瓶内，于 115高压蒸汽灭菌 20 min，储存于冷暗处备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的 1%苯胺蓝水溶液 1 ml 及 1%玫瑰红酸溶液 （溶于 8.0 g/L 氢氧化钠液中） 1 ml，混合均匀。如培养物中杂菌不多，则不加玫瑰红酸亦可。加热溶解前，加入 1.2%1.5%琼脂可制成固体培养基。也可选用市售成品培养基。配制好的培养基避光、干燥保存，必要时在 53冰箱中保存，分装到平皿中的培养基可保存 24 周。配制好的培养基不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变化，或脱水明显时应废弃不用。 6.2 无菌滤膜：直径 50 mm，孔径 0.45 m 的醋酸纤维滤膜，按无菌操作要求包扎，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需更换水洗涤 23 次。 6.3 无菌水：取适量实验用水，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 6.4 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O） 。 6.5 乙二胺四乙酸二钠（C10 H14N2O8Na22H2O） 。 6.6 硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/ml 称取 15.7 g 硫代硫酸钠（6.4） ，溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。 6.7 乙二胺四乙酸二钠溶液：（C10 H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/ml 称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.5） ，溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液可保存 30 d。 7 仪器和设备 7.1 采样瓶：1 L、500 ml 或 250 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。 7.2 高压蒸汽灭菌器：115、121可调。 7.3 恒温培养箱：允许温度偏差 44.50.5。 7.4 过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力勿超过50 kPa。 7.5 pH 计：准确到 0.1 pH 单位。 7.6 培养皿：直径 90 mm。 7.7 一般实验室常用仪器和设备。 注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min 备用。 HJ 347.12018 3 8 样品 8.1 样品采集 点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。 采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。样品采集量可根据水体实际情况而定，一般不少于 250 ml。 采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，距水面 1015 cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。 从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。 采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。 如果采集的是含有活性氯样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.6） ，以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液） ；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7） ，以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液） 。 注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.4）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。 8.2 样品保存 采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品在 4以下冷藏并在 2 h 内检测。 9 分析步骤 9.1 样品过滤 根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为 10 ml，如接种量小于 10 ml 时应逐级稀释。先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的 1/10 和 10 倍，分别过滤。理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为 2060 个，总菌落数不得超过 200 个。当最小过滤体积为 10 ml，滤膜上菌落密度仍过大时， 则应对样品进行稀释。 110 稀释的方法为： 吸取 10 ml 样品， 注入盛有 90 ml无菌水（6.3）的三角烧瓶中，混匀，制成 110 稀释样品。样品接种量参考表见表 1。 用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜（6.2）贴放在已灭菌的过滤装置（7.4）上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水（6.3）冲洗器壁 23 次。样品过滤完成后，再抽气约 5 s，关上开关。 9.2 培养 用灭菌镊子夹取滤膜移放在 MFC 培养基（6.1）上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，44.50.5培养 24 h2 h。 HJ 347.12018 4 表 1 样品接种量参考表 接种量/ml 样品类型 100 10 1 0.1 102 103 104 105 水源水 湖泊（水库） 地表水 河流 生活污水 处理前 废水 工业废水 处理后 地下水 9.3 对照试验 9.3.1 空白对照 每次试验都要用无菌水（6.3）按照步骤 9.1 和 9.2 进行实验室空白测定。 9.3.2 阳性及阴性对照 将粪大肠菌群的阳性菌株 （如大肠埃希氏菌Escherichia coli） 和阴性菌株 （如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes）制成浓度为 40600 CFU/L 的菌悬液，分别按照步骤 9.1 和 9.2 培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 10 结果计算与表示 10.1 结果判读 MFC 培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落，予以计数。 MFC 培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落，不予计数。 结果判读参考图片见图 1。 阳性菌落 阴性菌落（箭头指示处） 无菌落生长 图 1 结果判读参考图片 HJ 347.12018 5 10.2 结果计算 样品中的粪大肠菌群数（CFU/L） ，按照式（1）进行计算： 11000CCf= （1） 式中：C样品中粪大肠菌群数，CFU/L； C1滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数，个； 1 000将过滤体积的单位由 ml 转换为 L； f 样品接种量，ml； 注：若平行样结果都在 2060 CFU/L 范围内，最终结果取平均值以几何平均计算。 10.3 结果表示 测定结果保留至整数位， 最多保留两位有效数字， 当测定结果100 CFU/L 时， 以科学计数法表示。粪大肠菌群检验记录及报告格式参见附录 A。 11 精密度和准确度 11.1 精密度 6 个实验室对低浓度（地下水，浓度均值为 2.0102 CFU/L） 、中浓度（地表水，浓度均值为 1.6105 CFU/L）和高浓度（生活污水，浓度均值为 1.6107 CFU/L）三个不同浓度粪大肠菌群的实际样品和有证标准样品（浓度为 3670 MPN/L，可接受范围为 3307710 MPN/L）进行了 6 次重复测定：实验室内相对标准偏差范围分别为 5.3%12%、0.81%2.1%、0.51%4.2%和 7.7%9.8%；实验室间相对标准偏差分别为 6.8%、3.9%、4.0%和 3.6%；实验室间 95%置信区间见表 2。 表 2 实验室间 95%置信区间 低浓度/（CFU/L） 中浓度/（CFU/L） 高浓度/（CFU/L） 标准样品/（CFU/L） 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 均值 95%置信区间 2.0102 1.41022.9102 1.6105 9.81042.6105 1.6107 8.21063.0107 6.1102 3.81029.9102 11.2 准确度 6 个实验室对含粪大肠菌群浓度为 3 670 MPN/L（可接受范围为 3307 710 MPN/L）的标准样品进行了 6 次重复测定：相对误差范围为19%32%；相对误差最终值为：23%10%。 注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以 10 为底对数转换后进行计算。 12 质量保证和质量控制 12.1 培养基检验 更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验， 将粪大肠菌群测定的阳性菌株 （如大肠埃希氏菌 Escherichia coli） 和阴性菌株 （如产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes） 配成适宜浓度， 按样品过滤 （9.1）HJ 347.12018 6 的要求使滤膜上生长的菌落数为 2060 个，然后按培养（9.2）的要求进行操作，阳性菌株应生长为蓝色或蓝绿色菌落，阴性菌株应生长为灰色、淡黄色、无色或无菌落生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 12.2 对照试验 12.2.1 空白对照 每次试验都要用无菌水做实验室空白测定（9.3.1） ，培养后的培养基上不得有任何菌落生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 12.2.2 阳性及阴性对照 定期按照 9.3.2 进行阳性及阴性对照试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 13 废物处理 使用后的废物及器皿须经 121高压蒸汽灭菌 30 min 或使用液体消毒剂（自制或市售）灭菌后，器皿方可清洗，废物作为一般废物处置。 14 注意事项 当样品浑浊度较高时，应选用其他方法。 HJ 347.12018 7 附 录 A （资料性附录） 粪大肠菌群检验记录及报告格式 表 A.1 粪大肠菌群测定检验记录 项目名称： 检验日期： 年 月 日 检验方法 方法依据 灭菌锅型号 出厂编号 培养箱型号 出厂编号 培养基灭菌温度/ 培养温度/ 样品编号： 过滤体积 ml 滤膜上生长的菌落总数 个 稀释倍数（D） 倍 结果 CFU/L 检验者： 校对： 审核： 注：可根据实际工作需要自行设计表格，至少要包括上述信息。 表 A.2 粪大肠菌群测定数据报告格式 样品来源 采/送样日期 分析日期 样品数量 样品状态 监测点位 样品编号 监测频次 标准方法名称 标准方法编号 测定值： 监测结果： 备注 注：可根据实际工作需要自行设计表格，至少要包括上述信息。