超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中18种磺胺类药物残留.pdf

年月J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y第 卷第 期收稿日期:作者简介:林庆昶(),男,农艺师,主要从事食品和农产品质量安全检测工作.通讯作者:贾晓菲(),女,高级工程师,主要从事食品和农产品质量安全检测工作.超超高高效效液液相相色色谱谱串串联联质质谱谱法法测测定定禽禽蛋蛋中中 种种磺磺胺胺类类药药物物残残留留林庆昶,何思聪,贾晓菲,林小贞,谭淑铧,温 馨(中山市农产品质量安全检验所,广东 中山 )摘要:建立了超高效液相色谱串联质谱法(U P L CM S/M S)测定禽蛋中 种磺胺类药物的方法.禽蛋样品由甲酸乙腈提取后,经P R i ME HL B固相萃取柱净化,采用A g i l e n tP o r o s h e l l E CC 色谱柱(mm mm,m)进行分离,以 甲酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,质谱采集采用电喷雾正离子模式,通过多反应监测(MRM)方式进行了检测.结果显示:种磺胺类药物在 n g/m L浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)为 .在、g/k g个添加水平下,其平均回收率均在 ,相对标准偏差(R S D,n)均小于等于 ,方法定量限为 g/k g.可见该方法准确可信、简单高效、灵敏度高,适宜应用于禽蛋中 种磺胺类药物的快速检测.关键词:P R i MEHL B;禽蛋类食品;磺胺类药物;超高效液相色谱串联质谱法中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()D e t e r m i n a t i o no f S u l f o n a m i d e sR e s i d u e s i nP o u l t r yE g g sb yU P L CM S/M SL i nQ i n g c h a n g,H eS i c o n g,J i aX i a o f e i,L i nX i a o z h e n,T a nS h u h u a,W e nX i n(Z h o n g s h a nQ u a l i t yS a f e t ya n dT e s tC e n t e ro fA g r i c u l t u r a lP r o d u c t s,Z h o n g s h a n,G u a n g d o n g ,C h i n a)A b s t r a c t:A m e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f s u l f o n a m i d e r e s i d u e s i ne g g sb yU P L CM S/M Sw a se s t a b l i s h e d T h es a m p l ew a se x t r a c t e dw i t ha c e t o n i t r i l es o l u t i o nc o n t a i n i n g f o r m i ca c i d,p u r i f i e db yP R i ME HL Bs o l i dp h a s ee x t r a c t i o nc o l u m n,a n a l y z e db y A g i l e n tP o r o s h e l l E CC c o l u m n(mm mm,m)u s e d f o r m i ca c i da n dm e t h a n o l a st h em o b i l ep h a s e,s c a n n e db ye l e c t r o s p r a ys o u r c ep o s i t i v ei o na n dd e t e c t e db y m u l t i p l er e a c t i o n m o n i t o r i n g m o d e(MRM)T h er e s u l t ss h o w s t h a t t h e r ea r eg o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p sb e t w e e n s u l f o n a m i d ed r u g s i n n g/m L,w i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t(r)o f T h ea v e r a g er e c o v e r yr a t e sw e r e a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n(R S D,n)w a s l e s s t h a no r e q u a l t o a t t h e t h r e e l e v e l so f ,a n d g/k g T h e l i m i t o f q u a n t i f i c a t i o nw a s g/k g I t s h o w s t h a t t h em e t h o d i s a c c u r a t e,r e l i a b l e,s i m p l e,r a p i da n dh i g hs e n s i t i v i t y T h em e t h o di ss u c c e s s f u l l yu s e dt od e t e c tt h er e s i d u e so f s u l f o n a m i d e s i ne g g s K e yw o r d s:P R i MEHL B;e g g s;s u l f o n a m i d e s;U P L CM S/M S 引言禽蛋因其价格便宜且具有很高的营养价值,常作为人饮食中补充蛋白质的主要来源之一.然而,随着人们对优质便宜蛋白质的需求提高,禽蛋生产规模化发展,饲养过程不可避免地采用各种抗生素兽药来进行疾病的防治.其中磺胺类药物是产蛋家禽饲养过程中常用兽药之一.磺胺类药物 年月绿 色 科 技(J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y)第 期是一种广谱抗生素,临床上主要用于预防和治疗感染类疾病,其性质稳定、品种多、价格低、使用简便等优点,在兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物被广泛应用.但如果使用不规范或未遵守休药期会导致兽药在禽蛋产品中残留,危害到人们的身体健康,.因此出于社会的发展需求和对消费者的保护,食品安全国家标准中规定了家禽以及蛋类中磺胺类药物合并计算的最大残留量是 g/k g外,还规定了磺胺二甲嘧啶的单个最大残留量为 g/k g.动物源食品中磺胺类药物残留检测方法主要以高效液相色谱法(H P L C)和高效液相色谱串联质谱法(H P L CM S/M S)为主,.由于液相色谱串联质谱法(H P L CM S/M S)在灵敏度、抗干扰和定性方面都明显优于液相色谱法(H P L C),近年来,动物源性食品中磺胺类药物检测的研究以高效液相串联质谱法(H P L CM S/M S)居多,而更进一步采用了超高效液相色谱串联高分辨质谱法(U P L CQT O FM S)的研究也有见报道.目前动物源食品中磺胺类药物检测常见的净化方法有分散固相萃取、固相萃取 和液液萃取 等技术.由于固相萃取装置简单、操作方便和适用范围广,故使用MC X固相萃取柱和HL B固相萃取柱进行固相萃取净化的方法在国家标准 和农业农村部标准 中都获得广泛使用.但是与P R i ME HL B固相萃取比较而言,MC X固相萃取柱和HL B固相萃取柱由于需要活化、上样、洗脱和收集这些步骤,存在溶剂消耗大,耗时长的缺点.P R i ME HL B固相萃取柱属于新型的固相萃取柱,在使用过程中无须活化,直接上样收集,步骤简单,效 率 高.目 前 在 国 内 外 都 有 一 些 使 用P R i MEHL B固相萃取柱进行前处理的研究,如牛奶、鸡肉和鸡蛋等磺胺类药物检测的前处理上使用,而且效果都不错,.虽然磺胺类药物检测研究报道很多,但大部分以动物组织,居多,涉及鸡蛋,的也有,但涉及其他禽蛋的就较少.因此本研究针对禽蛋(鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋)的 种磺胺类药物检测进行研究,采用操作简便快捷,高效率的P r i m eHL B固相萃取柱进行前处理,使用超高效液相色谱串联质谱(U P L CM S/M S)同时测定禽蛋产品中 种磺胺类药物残留.该方法具有灵敏度高、定性定量准确、操作简便的特点,适宜于禽蛋中 种磺胺类药物残留的快速筛查.材料与方法 材料 主要仪器超高效液相色谱串联质谱仪U P L CQQQ ,美国A g i l e n t公司;T 氮吹浓缩仪,瑞典B i o t a g e公司;VO R T E X漩涡混合仪,德国I KA公司;K S 振荡器,德国I KA公司;K S冷冻离心机,德国S I GMA公司;S P E A固相 萃 取 装 置,上 海 启 前;O a s i sP R i ME HL B(m g、m L),美国W a t e r s公司.主要试剂和标准品甲醇、乙腈均为色谱纯,美国S u p e l c o公司生产;甲酸为色谱纯,美国M e r c k公司生产;无水硫酸钠为分析纯,北京化工厂生产;纯水,屈臣氏公司生产.磺胺标准品:乙酰磺胺(S u l f a c e t a m i d e),纯度 、磺 胺 二 甲 异 嘧 啶(S u l f i s o m i d i n e),纯 度 、磺胺嘧啶(S u l f a d i a z i n e),纯度 、磺胺噻 唑(S u l f a t h i a z o l e),纯 度 、磺 胺 吡 啶(S u l f a p y r i d i n e),纯度 、磺胺甲嘧啶(S u l f a m e r a z i n e),纯 度 、磺 胺 二 甲 嘧 啶(S u l f a m e t h a z i n e),纯度 、磺胺对甲氧嘧啶(S u l f a m e t e r),纯 度 、磺 胺 甲 噻 二 唑(S u l f a m e t h i z o l e),纯 度 、磺 胺 甲 氧 哒 嗪(S u l f a m e t h o x y p y r i d a z i n e),纯度 、磺胺间甲氧嘧啶(S u l f a m o n o m e t h o x i n e),纯度 、磺胺氯哒嗪(S u l f a c h l o r o p y r i d a z i n e),纯度 、磺胺甲噁唑(S u l f a m e t h o x a z o l e),纯度 、磺胺二甲异噁唑(S u l f i s o x a z o l e),纯度 、酞磺胺噻唑(P h t h a l y l s u l f a t h i a z o l e),纯 度 、苯 甲 酰 磺 胺(S u l f a b e n z a m i d e),纯 度 、磺 胺 间 二 甲 氧 嘧 啶(S u l f a d i m e t h o x i n e),纯 度 、磺 胺 苯 吡 唑(S u l f a p b e n a z o l e),纯度 ,均为购自德国D r E h r e n s t o r f e rGm b H公司.方法 标准溶液配制分别准确称取 种磺胺类标准品于 m L容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制质量浓度为 m g/L的单标标准溶液储备液,于 避光保存;分别准确吸取浓度为 m g/L的单标标准溶液储备液 L定容到 m L容量瓶中,用甲醇定容至刻度线,摇匀得浓度为 g/m L混合标准溶液;再经逐级稀释,上机前用空白基质将混标配制成浓度分别为、n g/m L的校正曲线工作液.样品前处理准确称取g(精确至 g)禽蛋样品于 m L具塞塑料离心管中,加入甲酸乙腈 m L以及陶瓷均质子,涡旋混匀,高速震荡提取 m i n,r/m i n m i n进行 低温离心分离,将上清液移至 m L具塞塑料的新离心管中.在装有上清液的新离心管中加入 g无水硫酸钠,振荡林庆昶,等:超高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋中 种磺胺类药物残留环境与安全m i n,静置m i n.然后准确吸取m L上清液过P R i ME HL B固 相 萃 取 柱 净 化,收 集 的 流 出 液,氮气吹至近干,用m L 甲酸水甲醇()溶液定容,涡旋后过膜上机测定.仪器条件 色谱条件色谱柱:A g i l e n tP o r o s h e l l E CC 色谱柱(mm mm,m);柱温:;流速 m L/m i n;进样量:L;流动相:甲酸水溶液甲醇,梯度洗脱,详见表.质谱条件电喷雾离子源(J e tS t r e a mE S I);干燥气温度:;干燥气流量:L/m i n;雾化气压力:p s i;表液相色谱梯度洗脱程序时间/m i n 甲酸水溶液/甲醇/鞘气温度:;鞘气流量:L/m i n;毛细管电压:k V;正离子模式扫描;多反应监测(MRM)采集方式;种磺胺类药的质谱采集参数见表.表 种磺胺类药物质谱采集参数化合物名称C a sN O分子量母离子(M/Z)碎裂电压子离子(M/Z)碰撞能v乙酰磺胺 /磺胺二甲异嘧啶 /磺胺嘧啶 /磺胺噻唑 /磺胺吡啶 /磺胺甲嘧啶 /磺胺二甲嘧啶 /磺胺对甲氧嘧啶 /磺胺甲噻二唑 /磺胺甲氧哒嗪 /磺胺间甲氧嘧啶 /磺胺氯哒嗪 /磺胺甲噁唑 /磺胺二甲异噁唑 /酞磺胺噻唑 /苯甲酰磺胺 /磺胺间二甲氧嘧啶 /磺胺苯吡唑 /方法评价 试剂标准曲线绘制以 种磺胺类药物的各色谱峰的峰面积为纵坐标,校正曲线标准混合工作液的浓度为横坐标,绘制各 目 标 化 合 物 标 准 曲 线,其 相 关 系 数、回归 方 程 见 表.所 有 目 标 化 合 物 在 n g/m L范 围 内 线 性 关 系 良 好,r值 均 大 于 .添加回收率、精密度和定量限的测定在相同的前处理和仪器分析条件下,对未检出 种磺胺类药物的鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋空白样品进行加标实验,添加水平为、g/k g,每个浓度平行,考察加标回收和精密度.种磺胺类药物的加标回收率为:,相对标准偏差:.方法回收率和表禽蛋中 种磺胺类药物的回归方程和相关系数化合物名称回归方程r乙酰磺胺y x 磺胺二甲异嘧啶y x 磺胺嘧啶y x 磺胺噻唑y x 磺胺吡啶y x 磺胺甲嘧啶y x 磺胺二甲嘧啶y x 磺胺对甲氧嘧啶y x 磺胺甲噻二唑y x 磺胺甲氧哒嗪y x 磺胺间甲氧嘧啶y x 磺胺氯哒嗪y x 磺胺甲噁唑y x 磺胺二甲异噁唑y x 酞磺胺噻唑y x 苯甲酰磺胺y x 磺胺间二甲氧嘧啶y x 磺胺苯吡唑y x 年月绿 色 科 技(J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y)第 期精密度符合 实验室质量控制规范 食品理化检测(G B/T )要求.方法定量限按最低添加水平 g/k g响应值与基线噪声响应的 倍或以上计算,种磺胺类药物的响应信号与噪声比值均大于.种磺胺类药物的方法定量限为 g/k g.定量限能满足 食品安全国家标准食品中 种兽药最大程度残留限量(G B )的限量检测要求.表鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋样品添加浓度回收率、相对标准偏差和定量限化合物名称添加含量/(g/k g)回收率及相对标准偏差/鸡蛋鸭蛋鹅蛋定量限/(g/k g)乙酰磺胺 磺胺二甲异嘧啶 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺吡啶 磺胺甲嘧啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲噻二唑 磺胺甲氧哒嗪 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺氯哒嗪 磺胺甲噁唑 磺胺二甲异噁唑 酞磺胺噻唑 苯甲酰磺胺 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺苯吡唑 林庆昶,等:超高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋中 种磺胺类药物残留环境与安全 结果与讨论 液相方法优化由于磺胺类药物部分药物存在同分异构药物,分子量和离子对相同,因此需要在色谱分离条件上考虑同分异构药物的分离效果.同时考虑到磺胺类药物属于两性化合物,磺胺类药物的待测物母离子均为MH,在酸性条件下更容易加氢,形成带电离子,提高响应.所以在质谱正模式下一般会往水相中加入适量的甲酸或乙酸.有研究发现在水相中加入适量的甲酸,对色谱的分离效果能有一定的提高.在有机相选择方面,一般以甲醇或乙腈为主.有研究发现使用甲醇为有机相时,色谱峰型对称性和效果优于乙腈.故最终确定流动相使用 甲酸水甲醇的组合,使用梯度洗脱的方法进行分离.这样既保证磺胺类药物MH母离子的形成,提高响应,也达到更好的峰型对称性和峰分离度.质谱条件优化使用两通代替液相色谱柱,将 g/m L浓度的磺胺类药物单标溶液L分别注入系统,采用正离子扫描模式对相应模式的母离子进行扫描,待测物母离子均为MH,以准分子离子为母离子进行二级质谱扫描,得到响应值最高的各个化合物碎片离子,每个化合物选择响应最高的个子离子作为定性定量分析.多反应MRM参数见表.各化合物的第一个子离子为定量离子.相关质量色谱图详见图.年月绿 色 科 技(J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y)第 期图 种磺胺类药物多反应监测(MRM)质量色谱 提取液的选择乙酸乙酯、甲醇和乙腈都是提取磺胺类药物的常用提取溶剂,相对于其他种有机提取溶剂,乙腈的极性与磺胺类药物接近,同时也可以使对禽蛋样品中的磷脂类蛋白质有很好的等电沉淀的效果.特别是使用酸化乙腈进行提取,能够更好使目标物与蛋白质分离,提高提取效率.有结果表明使用甲酸乙腈作为提取液时,提取效率更理想.最后综合考虑后,选择甲酸乙腈作为提取液的选择.S P E固相萃取柱的选择禽蛋样品基质相较组织样品更为复杂,对净化处理要求更高.固相萃取是检测磺胺类物质通常选用的净化方法之一.常用的净化固相萃取柱有HL B和MC X固相萃取柱.有相关研究结果显示P R i MEHL B固相萃取柱的磺胺类药物回收率略高于HL B和MC X固相萃取柱,而且P R i MEHL B固相萃取柱净化过程操作更简便快捷,过程更易控制,对于基质较为复杂的禽蛋样品,不会像在过HL B和MC X固相萃取柱时经常出现堵塞柱子的情况,导致回收率不稳定的情况出现.也有相关报道显示P r i m eHL B固相萃取柱在牛奶、鸡肉和鸡蛋等磺胺类药物检测的净化前处理上使用,而且效果都不错,.因此本实验采用P r i m eHL B固相萃取柱对样品进行净化.定容溶液的选择本实验使用的流动相为 甲酸水溶液和甲醇溶液,初始流动相为 水相,定容液有机相的比例过高容易带来明显的溶剂效应,尤其以极性较大的化合物最明显.但如定容液水相的比例过林庆昶,等:超高效液相色谱串联质谱法测定禽蛋中 种磺胺类药物残留环境与安全高,在氮吹干后未能完全溶解所有磺胺类药物,导致回收率会降低.有研究结果表明,当定容液中水相在 时,部分药物响应会有所提高,峰型得到改善.因此本研究最终选择了 甲酸水甲醇()溶液进行氮吹后的定容液.结论本实验采用P r i m eHL B固相萃取柱前处理,操作简便快捷,效率高;使用超高效液相色谱串联质谱联(U P L CM S/M S)用技术,建立了禽蛋中 种磺胺类药物残留量的检测方法.该方法具有简单快速、易操作和灵敏度高,净化效果明显等优势,定量限能满足 食品安全国家标准食品中 种兽药最大残留限量(G B )的限量检测要求,可用于畜蛋中 种磺胺类药物的检测.参考文献:H o n eM,T i mm o n s J,E g a nB I n c r e a s e s i np r o t e i n i n t a k e,p r o t e i nd i s t r i b u t i o ns c o r e,a n dm i c r o n u t r i e n t i n t a k e s i no l d e r a d u l t si nr e s p o n s e t oaw h o l e f o o d b a s e dd i e t a r y i n t e r v e n t i o nJ A g i n g C l i n i c a l A n d E x p e r i m e n t a l R e s e a r c h,():陈敏艳,王香敏,朱弘,等畜禽产品兽药残留危害现状与分析J动物医学进展,()P i e i r oSA,C e r n i g l i aCEA n t i m i c r o b i a ld r u gr e s i d u e s i na n i m a l d e r i v e df o o d s:P o t e n t i a l i m p a c to nt h eh u m a ni n t e s t i n a lm i c r o b i o m eJ J o u r n a l o fV e t e r i n a r yP h a r m a c o l o g ya n dT h e r a p e u t i c 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