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第 卷第 期 年 月中国耳鼻咽喉颅底外科杂志 ：论著 测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义基金项目：福建省自然科学基金项目（）。第一作者简介：庄黎明，女，主任医师，副教授。通信作者：蔡耿明，：；叶辉，：；蔡成福，：庄黎明，丁雅婷，蔡成福，叶辉，蔡耿明，（福建医科大学附属泉州市第一医院 耳鼻咽喉头颈外科，福建 泉州 ；泉州市医学高等专科学校附属人民医院 耳鼻咽喉科，福建 泉州 ；厦门医学院附属海沧医院 耳鼻咽喉头颈外科，福建 厦门 ；福建医科大学临床医学部，福建 福州 ）摘要：目的研究 甲基腺苷（）修饰在中晚期头颈部鳞状细胞癌（）的作用和基因相关通路，为头颈部 患者的个体化精准治疗提出新的观点及研究参考。方法选取 对临床中晚期 患者的癌及其癌旁组织（个样本）进行测序，从癌和癌旁组织的转录组、相关差异基因中筛选出两者共同的差异基因，通过基因本体（）分析、分析及蛋白相互作用（）分析，找出其中的枢纽（）基因，随后对网络中的基因进行基因集变异分析（），从而得到 修饰影响的基因及通路。结果从癌与癌旁组织的差异基因中筛选出 个转录组 相关的上调基因、个 相关下调基因；信号通路分析发现 通路、免疫相关通路下调，代谢通路上调；构建 后发现，呈现上调趋势，而 及 均呈现下调趋势；分析发现 信号通路在癌组织中上调；中的 基因共表达分析发现 和 在 调控下，与铁死亡相关基因联系很密切。结论 修饰与 、等铁死亡相关基因紧密相关，修饰可能通过铁死亡相关基因影响免疫、代谢相关通路，从而在中晚期 中起重要作用。关键词：测序；甲基腺苷；头颈部鳞状细胞癌中图分类号：，（，；，；，；，）：（）（），（），（），（），庄黎明，等：测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期 （），（），（），（）（）（），（），（），（），（），：；头颈癌（，）是世界上第种最常见的癌症。根据 年全球癌症统计，的发病人数约为 例，占所有恶性肿瘤的 。的发病机制是一个多步骤的过程，涉及分子变化的渐进积累。进一步阐明 发展中涉及的分子事件，可能有助于识别潜在和有效的生物标志物，并为靶向治疗提供新的方向 。头颈部鳞状细胞癌（，）是其中发生率最高的一类。标准疗法如保留器官的微创手术方法、放疗和多模式治愈性疗法等的改进已经可以更好地保留患者的头颈部器官的功能，并提高患者的 年生存率 ，但是复发性或转移性患者的疗效及预后仍差强人意。基于 细胞的免疫治疗，已被证明能提高复发性或转移性 患者的总生存率 ，但只有很低比例的患者对此疗法有响应，还存在免疫耐受和免疫逃逸等问题，因此，转移性、复发性和晚期 患者的预后仍然不理想。对 进展和转移形成的机制已经有深入的研究，但仍需要开发新的治疗策略 。修饰，例如 甲基腺苷（，），在表观遗传基因调控和细胞功能中发挥着不可忽视的作用，与许多人类疾病密切相关。是在真核细胞中记录的最常见的转录后 修饰，这些修饰大多发生在 和 非翻译区（）以及内部长外显子的信使核糖核酸终止密码子附近，在许多生理和病理过程中起着重要作用，包括产生免疫反应、微小 的编辑和各种癌症的进展 。目前已有研究表明，修饰失调与胶质母细胞瘤、乳腺癌症、胃癌、结直肠癌及甲状腺乳头状癌 等肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明 ，喉鳞状细胞癌（，）患者的预后，可以通过 相关的 表达量构建的预后模型预测。然而，修饰在 进展中的作用还需要进一步研究 。材料与方法 分析流程分析过程流程见图 。选 取?对 中 晚 期?患者的癌组织及癌旁组织进行测序从原发和癌旁的转录组?相关差异基因?筛选出两者共同的差异基因对应被?调控的?进行蛋白质的结合预测?得到可能被调控的蛋白以及在转录组的相关性转录组上调?上调转录组下调?下调?和?分析?分析从基因之间的网络结合关系中?找出其中的?基因对?基因进行共表达的分析?分析获得其基因之间有密切关系的基因素基因影响的通路和从癌旁到肿瘤的变化过程?即?调控影响的通图 数据收集分析过程注：（头颈部鳞状细胞癌）；（基因本体）；（京都基因与基因组）；（蛋白相互作用）；（基因集变异分析）。中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷 数据处理 提取、文库制备和测序 提取、文库制备和高通量测序的数据分析均由中国有限公司赛格健康科技有限公司进行。按照 等 的方法，使用 （，），从临床收集的 对癌及癌旁组织样品中提取总 。在 （，）提取 后进行 消化。质量通过用 分光光度计（，）检测 来测定。经证实完整性及合格后通过 荧光计（，）与 测定试剂盒（，）进行定量。对应于 的文库产物进行富集、定量，并最终在 （）上测序。序列数据分析原始测序数据首先通过 （版本 ）进行过滤，去除低质量及被污染的读数。首先根据唯一分子标识符（，）序列进行聚类，相同 序列分组到同一聚类。生成所有子聚类后，进行多序列比对，得到每个子聚类的一个一致序列。新基因和转录物的预处理、比对和分析使用 软件（版本 ）对原始读取进行基础调用，评估读取质量，还对适配器序列进行了修剪。（版）过滤低质量（值 ）和短长度读数（）。使用 （版本 ）和短长度 数据校正剩余的干净读数 。然后，使用 （版）将每个文库的干净读数与其基因组进行比对 。使用 （版）计算干净读数与参考基因的比对率 。为了减少结果的冗余，合并仅在 端外显子差异的比对，并使用 软件（版本：；参数：保守性 ）获得非冗余转录序列。软件（版本：；参数：）用于将转录物与基因组的已知转录物进行比较，并发现新的转录物和新的基因。为了获得新转录物的全面功能信息，根据序列相似性和基序相似性对 个数据库的转录物进行了注释，包括 、京都基因与基因组（）、基因本体（，）、和 。基因转录物的结构分析将转录本与已知的基因组转录本进行比较，以校正边界。测序质量控制对牛津纳米孔测序技术（，）原始测序数据进行质量控制。数据过滤根据二代及三代数据过滤标准，对数据进行过滤，从而得到有效数据。功能注释和通路富集分析对上述对照组鉴定的差异表达基因（，）进行功能注释，富集分析使用了 术语的注释和可视化和元景观。术语的不同表达基因列表之间的重叠通过富集分析圆图进行。然后将 引入 （功能富集分析工具）（：）用于 通路分析。用于构建 的基因 基因相互作用网络，以评估这些基因的功能。蛋白 蛋白相互作用（，）网络的构建交集的基因通过 进行基因之间的相互作用预测，得到它们之间的关系，筛选标准为 。并通过 软件（）进行网络图的构建可视化。共表达的 基因通过对 中的基因进行共表达分析，从而发现它们之间的表达关系，进而发现它们在此实验中的调控关系。基因集变异分析（，）使用软件 （版本 ）的 包分析 。结果 转录组差异基因与差异 的差异基因的交集首先通过癌与癌旁组织对比得到转录组差异基因筛选出来，标准为 且 或者 。将 的差异基因筛选出，标准为 且 或者 。通过两组差异基因筛选出转录组上调和 上调的基因以及转录组下调和 下调的基因。我们得到 个上调基因（转录组上调 上调）和 个下调基因（转录组下调 下调）。交集基因的富集分析首先将交集基因按照上调和下调基因来做富集分析，从而得到它们各自的方向，具体见表 。庄黎明，等：测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期表 交集基因的富集分析编码描述基因比背景比率矫正后 基因识别符拷贝数 ：补体激活，替代途径 ：聚糖加工 ：铁离子稳态 ：体液分泌 ：组织分泌 ：蛋白 连 接 糖基化 ：过渡金属稳态 ：铁离子转运 ：骨化调节 ：肺发育 ：体液免疫反应 ：骨矿化作用 ：脂肪酸代谢过程 ：呼吸管发育 ：平滑肌细胞增值负调控 ：?肽酶活性负调控 ：补体激活 ：肽酶活性负调控 ：上皮细胞液体转运 ：磷脂生物合成正调节 ：骨化 ：黏膜免疫反应 ：调节骨矿化 对这部分的基因进行功能以及 的富集分析，对显著性差异基因功能分别做了柱状图（图 ），显著性筛选的标准为 。差异基因信号通路分析根据差异基因通路中每一通路的显著性水平（值）和所包含的差异基因数据（表 ）构建显著性差异基因通路的分布图。对部分显著性差异基因通路做了气泡图（图 ）。从通路的结果中可以看出：在癌组织中 通路下调，免疫相关通路下调，以及代谢通路的上调，从而影响了肿瘤的发展和增殖。中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷?图 部分基因功能及 富集分析中显著性差异的基因注：纵坐标为差异基因功能名称，横坐标为 值的负对数（）；图中仅显示按照 排序最大的各前 项。（含胶原蛋白的细胞外基质）；（分泌颗粒腔）；（细胞质囊腔）；（囊泡腔）；（血液微粒子）；（三级颗粒腔）；（微滤膜）；（内质网腔）；（细胞顶端）；（顶端质膜）；（细胞外基质结构成分）；（糖胺聚糖结合）；（肝素结合）；（细胞外基质中具有抗压性的结构成分）；（氧化还原酶活性）；（胶原蛋白结合）；（内肽酶抑制剂活性）；（肽酶抑制剂活性）；（内肽酶调节器活性）；（硫化合物结合）；，（补体激活，替代途径）；（型糖加工）；（铁离子稳态）；（体液分泌）；（组织分泌）；（蛋白质 链接糖基化）；（过渡金属离子稳态）；（铁离子运输）；（骨化调节）；（肺发育）。下同。表 差异基因数据分析编码描述基因比背景比率矫正后 基因识别符拷贝数 黏蛋白型 糖生物合成 补体和凝血级联 肾素分泌 信号通路 糖磷脂的生物合成内酯和新内酯系列 金黄色葡萄球菌感染 铁死亡 脂肪酸降解 其他类型 糖生物合成 膦酸盐和膦酸盐代谢 产生 的肠道免疫网络 疟疾 庄黎明，等：测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期?图 显著性差异基因通路气泡图注：纵坐标为差异基因通路名称，横坐标为富集程度（）；（黏蛋白型 糖的生物合成）；（补体和凝血级联）；（肾素分泌）；（信号通路）；（糖磷脂的生物合成 内酯和新内酯系列）；（金黄色葡萄球菌感染）；（铁死亡）；（脂肪酸降解）；（其他类型的 糖生物合成）；（膦酸盐和膦酸盐代谢）；（产生 的肠道免疫网络）；（疟疾）。下同。的建立通过 对上述交集的基因进行基因之间的相互作用预测，得到它们之间的关系，并通过 软件进行网络图的构建可视化构建，点用来表示基因，线用来表示基因之间的关系，其中颜色表示上下调的关系和程度，红色表示上调基因，而绿色表示下调基因，颜色越深表示变化越显著。通过构建差异基因的作用网络，得到基因之间的作用关系。基因的度排序结果见表 。通过癌与癌旁组织进行差异基因分析发现，、均呈现下调趋势，而 、均呈现上调的趋势（表 ）。通过癌和癌旁组织的 个样本的转录组测序技术（，），其每千个碱基的转录每百万映射的 （，）值进行 分析（：用来体现每个样本的在某个通路的变化情况）。运用 检验方法筛选，通过基因的信号值预测每个样本的富集得分值，计算两组之间的富集差异性，得到有差异富集的通路。从图 可见 信号通路为在肿瘤中上调，通路在肿瘤中为抑制通路。表 基因的度与作用趋势基因名称度形式 下调 上调 上调 上调 下调 下调 上调 上调 上调 下调注：度表示基因和其他基因关联的个数，如度 代表与该基因有相互作用关系的基因有 个，度越大，代表与它有相互作用的基因越多。中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷 共表达的 基因通过对 中的基因进行共表达分析，从而发现它们之间的表达关系，进而发现它们在此实验中的调控关系。通过计算 中的基因之间的共表达关系，具体见图 。从图 中 共表达关系，我们发现 、在 调控下，与周围的基因联系很密切，具体结果见表 。?图 个样本在不同分型的样本富集得分值注：图中颜色是由蓝向红来变化，表示富集分数数值的升高，表示通路被激活。?图 中基因的共表达关系注：深蓝色表示基因的度越大，而浅色表示基因的度越小。庄黎明，等：测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期表 共表达基因的度名称度 讨论由于肿瘤的异质性、对包括免疫治疗在内的多种治疗效果不佳，以及耐药性等问题的存在。患者，特别是复发性和中晚期患者的治疗效果和预后并不令人满意，适当的个体化治疗方案需要进一步去探索和建立，从而有效提高和改善 患者的治疗效果和预后。既往的研究表明，调节因子的异常表达可能与多种癌症的发生发展有关，包括乳腺癌症、膀胱癌症、胶质瘤和结直肠癌等。与正常组织相比，某些 相关基因在 组织中的表达上调，与免疫细胞浸润以及免疫检查点抑制剂（，）治疗的反应和结果有关 。从 共表达关系图中，我们发现在 调控下，共表达基因与周围的基因联系很密切，它们处于网络的中心位置。细胞周期蛋白依赖性激酶 （，）是一种丝氨酸 苏氨酸激酶，是细胞周期的主调节因子 ，它对细胞周期调节至关重要。在控制 复制、修复及 转录等功能作用中均能起到一定的作用 。一般情况下，细胞周期控制的失调主要引起肿瘤生长 ，的上调与肿瘤的增殖和进展相关。一项研究表明 ，铁死亡相关基因与 密切相关。并且有研究已验证了 可使 相关蛋白（）磷酸化 。几项研究均显示了 在几种恶性肿瘤中显著上调 。与之相关的是，可作为 的底物在部分癌症中上调，从而提高异常翻译存活率，导致癌细胞增殖增加。载脂蛋白 （，）是一种参与脂质转运和脂蛋白代谢的多功能蛋白，介导组织和细胞中的脂质分布 再分配。它还可以调节炎症和免疫功能，保持细胞骨架的稳定性，改善神经组织功能。近年来，频繁出现在肿瘤研究中，并逐渐成为肿瘤的生物标志物。研究发现 在许多肿瘤细胞，包括神经胶质瘤、卵巢肿瘤、口腔鳞状细胞癌症、胰腺导管细胞癌等大多数实体瘤组织中高表达。可以调节巨噬细胞的极化变化，参与肿瘤免疫微环境的构建，调节肿瘤炎症和免疫反应，在肿瘤侵袭和转移中发挥作用。许多研究已经证实 促进肿瘤的发展、增殖和转移，但最近的研究也发现 具有保护作用 。（）属于基质细胞蛋白，分泌到细胞外环境中的非结构 蛋白，在大多数成年组织中以低水平表达。这些蛋白质与细胞表面受体相互作用，介导细胞和细胞外通讯。在各种实体上皮肿瘤中过表达，其与细胞表面受体整合素的相互作用调节细胞内信号通路，对癌症有直接影响。它在转移中上调，并可影响转移病灶的大小和数量 。编码核糖体蛋白（，）是 亚基的组成部分，该蛋白属于核糖体蛋白的 家族，位于细胞质中。是一种铁死亡相关基因，它的表达随胰腺肿瘤分级而显著改变，与胰腺癌症预后相关，与胶质瘤癌症进展有关 。血小板参与肿瘤血管生成和癌症进展，是癌症生物标记物的潜在来源。研究发现，在癌症患者的血小板蛋白质组中上调 。簇蛋白是一种进化高度保守的糖蛋白，簇蛋白通过调节多种信号通路介导各种癌症（如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌和癌症）中的癌症进展，在调节几个基本生理过程中发挥了突出作用，包括程序性细胞死亡、转移、侵袭、增殖和细胞生长 。簇蛋白介导的线粒体自噬可以抑制口腔癌症的干性和自我更新能力 。它在神经保护和癌症以及化疗耐药性方面具有重要意义，被认为既是一种生物标志物，也是一种非常可探索的新治疗靶点，适用于多种疾病 。但簇蛋白在恶性肿瘤中的作用一直存在争议，它可以促进体外的肿瘤发生和对化疗药物的耐药性。然而，簇蛋白在小鼠体内也可能会限制神经母细胞瘤和癌症的发展，研究发现，它在抑制细胞死亡、调节促生存信号传导和增强肿瘤细胞化疗耐药性方面至关重要。簇蛋白高表达与膀胱癌患者生存率低明显相关，被定义为膀胱癌中的一种癌基因。它通过抑制细胞凋亡来增强癌症对顺铂的耐药性 。蛋白聚糖由铁死亡的细胞释放，然后作为警报信号触发先天和适应性免疫反应。铁死亡期间蛋白聚糖的早期释放是一个活跃的中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷过程，涉及分泌性大自噬 自噬和溶酶体胞吐作用。一旦释放，细胞外蛋白聚糖与巨噬细胞上的受体高级糖基化终产物特异性受体（）结合，以 依赖的方式触发促炎细胞因子的产生 。（也称为 ）是许多信号转导途径的中心枢纽蛋白，在肿瘤进展中起着重要作用。越来越多的证据表明，在多种类型的癌症中经常上调，并在细胞生长、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭等广泛的细胞活动中起致癌基因的作用。此外，可能是几种癌症的诊断、预后和化疗耐药性的潜在生物标志物 。临床上，高表达提示胃癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌等多种癌症患者预后差有关 。经典的铁死亡诱导剂 促进了软骨细胞中基质金属蛋白酶 的表达，同时抑制了型胶原的表达 。基因位于染色体 内，是一种蛋白质二硫键异构酶（，），家族成员作为氧化还原酶而发挥作用，负责催化二硫键的形成或重排，这是发生于细胞内质网中的一种关键蛋白质修饰。许多研究已证实，高表达于含有黏液分泌功能细胞的组织。肿瘤微环境（，）中成分复杂，包含肿瘤细胞、免疫细胞、肿瘤相关炎症细胞和成纤维细胞等细胞，此外还有组织间质、血管、细胞因子和趋化因子等。颈癌研究中发现，的表达于与 、和 之间存在相关性，表明 可能与头颈癌有关 。此外，在各种上皮肿瘤中表达上调，通过激活包括 激活途径在内的多种途径促进肿瘤的侵袭性生长、血管生成、侵袭、转移和耐药性等恶行生物学行为 。有趣的是，与已有研究相反，测序结果发现 、在中晚期 癌组织中表达，我们认为：实验所收集的标本为中晚期 标本，与上述研究的标本有所不同。它们可以逃离这个位置，在细胞表面或细胞外基质中发挥作用。转化生长因子 （，）的缺失可以抑制 。因为除了通过关键信号系统诱导 外，还可以通过 的介导调节 ，即 轴。的缺失可以抑制 从而可以抑制 肿瘤抑制活性 。测序显示 低表达，而功能研究表明，在前列腺癌中存在两种相悖的功能：通过雄激素受体（，）途径诱导前列腺癌细胞繁殖，同时 也可以通过不依赖 途径抑制癌细胞迁移和上皮 间皮转化（，）。及其辅因子 与一个特定的内含子雄激素响应元件结合，通过 调节前列腺癌的铁死亡 。是 相关蛋白（，）依赖性的转录因子，在转录因子 （，）作为 调控转录因子的情况下，可以于 一起调节 ，诱导铁蛋白轻链（，）转录，从而抑制铁死亡 ，。我们 测 序 的 数 据 结 果 表 明，修 饰 与 、等铁死亡相关基因紧密相关。铁死亡是铁依赖性的，以脂质过氧化为主要特征的一种区别于凋亡细胞死亡的一种独特的程序性死亡类型。已在包括癌症等的自身免疫疾病中被探索研究，并被作为新的治疗策略 。因此我们推测，修饰铁死亡相关基因在中晚期 中起重要作用，这需要进一步的实验深入研究证实。本研究探讨了 介导的中晚期 表观转录组学，对中晚期 的免疫逃逸进行初步的探讨，为 的个体化精准治疗提出新的观点。参考文献：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：李祖飞，赵晓畅，何帅 种 甲基化调节基因与甲状腺乳头状癌的相关性分析 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，（）：李念遷，韩杏倩，何金阳，等 基于 甲基腺苷相关长链非编码核糖核酸表达的喉鳞状细胞癌预后分析 中国耳鼻咽喉庄黎明，等：测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期颅底外科杂志，（）：，（）：，（）：，（），：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，：，：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷 ，：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）本文引用格式：庄黎明，丁雅婷，蔡成福，等 测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，（）：，（）：