Nanopore测序揭示m6A修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义.pdf
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1、第 卷第 期 年 月中国耳鼻咽喉颅底外科杂志 :论著 测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义基金项目:福建省自然科学基金项目()。第一作者简介:庄黎明,女,主任医师,副教授。通信作者:蔡耿明,:;叶辉,:;蔡成福,:庄黎明,丁雅婷,蔡成福,叶辉,蔡耿明,(福建医科大学附属泉州市第一医院 耳鼻咽喉头颈外科,福建 泉州 ;泉州市医学高等专科学校附属人民医院 耳鼻咽喉科,福建 泉州 ;厦门医学院附属海沧医院 耳鼻咽喉头颈外科,福建 厦门 ;福建医科大学临床医学部,福建 福州 )摘要:目的研究 甲基腺苷()修饰在中晚期头颈部鳞状细胞癌()的作用和基因相关通路,为头颈部
2、患者的个体化精准治疗提出新的观点及研究参考。方法选取 对临床中晚期 患者的癌及其癌旁组织(个样本)进行测序,从癌和癌旁组织的转录组、相关差异基因中筛选出两者共同的差异基因,通过基因本体()分析、分析及蛋白相互作用()分析,找出其中的枢纽()基因,随后对网络中的基因进行基因集变异分析(),从而得到 修饰影响的基因及通路。结果从癌与癌旁组织的差异基因中筛选出 个转录组 相关的上调基因、个 相关下调基因;信号通路分析发现 通路、免疫相关通路下调,代谢通路上调;构建 后发现,呈现上调趋势,而 及 均呈现下调趋势;分析发现 信号通路在癌组织中上调;中的 基因共表达分析发现 和 在 调控下,与铁死亡相关基
3、因联系很密切。结论 修饰与 、等铁死亡相关基因紧密相关,修饰可能通过铁死亡相关基因影响免疫、代谢相关通路,从而在中晚期 中起重要作用。关键词:测序;甲基腺苷;头颈部鳞状细胞癌中图分类号:,(,;,;,;,):()(),(),(),(),庄黎明,等:测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义第 期 (),(),(),()()(),(),(),(),(),:;头颈癌(,)是世界上第种最常见的癌症。根据 年全球癌症统计,的发病人数约为 例,占所有恶性肿瘤的 。的发病机制是一个多步骤的过程,涉及分子变化的渐进积累。进一步阐明 发展中涉及的分子事件,可能有助于识别潜在和有效的
4、生物标志物,并为靶向治疗提供新的方向 。头颈部鳞状细胞癌(,)是其中发生率最高的一类。标准疗法如保留器官的微创手术方法、放疗和多模式治愈性疗法等的改进已经可以更好地保留患者的头颈部器官的功能,并提高患者的 年生存率 ,但是复发性或转移性患者的疗效及预后仍差强人意。基于 细胞的免疫治疗,已被证明能提高复发性或转移性 患者的总生存率 ,但只有很低比例的患者对此疗法有响应,还存在免疫耐受和免疫逃逸等问题,因此,转移性、复发性和晚期 患者的预后仍然不理想。对 进展和转移形成的机制已经有深入的研究,但仍需要开发新的治疗策略 。修饰,例如 甲基腺苷(,),在表观遗传基因调控和细胞功能中发挥着不可忽视的作用
5、,与许多人类疾病密切相关。是在真核细胞中记录的最常见的转录后 修饰,这些修饰大多发生在 和 非翻译区()以及内部长外显子的信使核糖核酸终止密码子附近,在许多生理和病理过程中起着重要作用,包括产生免疫反应、微小 的编辑和各种癌症的进展 。目前已有研究表明,修饰失调与胶质母细胞瘤、乳腺癌症、胃癌、结直肠癌及甲状腺乳头状癌 等肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明 ,喉鳞状细胞癌(,)患者的预后,可以通过 相关的 表达量构建的预后模型预测。然而,修饰在 进展中的作用还需要进一步研究 。材料与方法 分析流程分析过程流程见图 。选 取?对 中 晚 期?患者的癌组织及癌旁组织进行测序从原发和癌旁的转录组?相关
6、差异基因?筛选出两者共同的差异基因对应被?调控的?进行蛋白质的结合预测?得到可能被调控的蛋白以及在转录组的相关性转录组上调?上调转录组下调?下调?和?分析?分析从基因之间的网络结合关系中?找出其中的?基因对?基因进行共表达的分析?分析获得其基因之间有密切关系的基因素基因影响的通路和从癌旁到肿瘤的变化过程?即?调控影响的通图 数据收集分析过程注:(头颈部鳞状细胞癌);(基因本体);(京都基因与基因组);(蛋白相互作用);(基因集变异分析)。中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷 数据处理 提取、文库制备和测序 提取、文库制备和高通量测序的数据分析均由中国有限公司赛格健康科技有限公司进行。按照 等 的方法
7、,使用 (,),从临床收集的 对癌及癌旁组织样品中提取总 。在 (,)提取 后进行 消化。质量通过用 分光光度计(,)检测 来测定。经证实完整性及合格后通过 荧光计(,)与 测定试剂盒(,)进行定量。对应于 的文库产物进行富集、定量,并最终在 ()上测序。序列数据分析原始测序数据首先通过 (版本 )进行过滤,去除低质量及被污染的读数。首先根据唯一分子标识符(,)序列进行聚类,相同 序列分组到同一聚类。生成所有子聚类后,进行多序列比对,得到每个子聚类的一个一致序列。新基因和转录物的预处理、比对和分析使用 软件(版本 )对原始读取进行基础调用,评估读取质量,还对适配器序列进行了修剪。(版)过滤低质
8、量(值 )和短长度读数()。使用 (版本 )和短长度 数据校正剩余的干净读数 。然后,使用 (版)将每个文库的干净读数与其基因组进行比对 。使用 (版)计算干净读数与参考基因的比对率 。为了减少结果的冗余,合并仅在 端外显子差异的比对,并使用 软件(版本:;参数:保守性 )获得非冗余转录序列。软件(版本:;参数:)用于将转录物与基因组的已知转录物进行比较,并发现新的转录物和新的基因。为了获得新转录物的全面功能信息,根据序列相似性和基序相似性对 个数据库的转录物进行了注释,包括 、京都基因与基因组()、基因本体(,)、和 。基因转录物的结构分析将转录本与已知的基因组转录本进行比较,以校正边界。测
9、序质量控制对牛津纳米孔测序技术(,)原始测序数据进行质量控制。数据过滤根据二代及三代数据过滤标准,对数据进行过滤,从而得到有效数据。功能注释和通路富集分析对上述对照组鉴定的差异表达基因(,)进行功能注释,富集分析使用了 术语的注释和可视化和元景观。术语的不同表达基因列表之间的重叠通过富集分析圆图进行。然后将 引入 (功能富集分析工具)(:)用于 通路分析。用于构建 的基因 基因相互作用网络,以评估这些基因的功能。蛋白 蛋白相互作用(,)网络的构建交集的基因通过 进行基因之间的相互作用预测,得到它们之间的关系,筛选标准为 。并通过 软件()进行网络图的构建可视化。共表达的 基因通过对 中的基因进
10、行共表达分析,从而发现它们之间的表达关系,进而发现它们在此实验中的调控关系。基因集变异分析(,)使用软件 (版本 )的 包分析 。结果 转录组差异基因与差异 的差异基因的交集首先通过癌与癌旁组织对比得到转录组差异基因筛选出来,标准为 且 或者 。将 的差异基因筛选出,标准为 且 或者 。通过两组差异基因筛选出转录组上调和 上调的基因以及转录组下调和 下调的基因。我们得到 个上调基因(转录组上调 上调)和 个下调基因(转录组下调 下调)。交集基因的富集分析首先将交集基因按照上调和下调基因来做富集分析,从而得到它们各自的方向,具体见表 。庄黎明,等:测序揭示 修饰铁死亡相关基因在中晚期头颈部鳞状细
11、胞癌中的表达及临床意义第 期表 交集基因的富集分析编码描述基因比背景比率矫正后 基因识别符拷贝数 :补体激活,替代途径 :聚糖加工 :铁离子稳态 :体液分泌 :组织分泌 :蛋白 连 接 糖基化 :过渡金属稳态 :铁离子转运 :骨化调节 :肺发育 :体液免疫反应 :骨矿化作用 :脂肪酸代谢过程 :呼吸管发育 :平滑肌细胞增值负调控 :?肽酶活性负调控 :补体激活 :肽酶活性负调控 :上皮细胞液体转运 :磷脂生物合成正调节 :骨化 :黏膜免疫反应 :调节骨矿化 对这部分的基因进行功能以及 的富集分析,对显著性差异基因功能分别做了柱状图(图 ),显著性筛选的标准为 。差异基因信号通路分析根据差异基因
12、通路中每一通路的显著性水平(值)和所包含的差异基因数据(表 )构建显著性差异基因通路的分布图。对部分显著性差异基因通路做了气泡图(图 )。从通路的结果中可以看出:在癌组织中 通路下调,免疫相关通路下调,以及代谢通路的上调,从而影响了肿瘤的发展和增殖。中国耳鼻咽喉颅底外科杂志第 卷?图 部分基因功能及 富集分析中显著性差异的基因注:纵坐标为差异基因功能名称,横坐标为 值的负对数();图中仅显示按照 排序最大的各前 项。(含胶原蛋白的细胞外基质);(分泌颗粒腔);(细胞质囊腔);(囊泡腔);(血液微粒子);(三级颗粒腔);(微滤膜);(内质网腔);(细胞顶端);(顶端质膜);(细胞外基质结构成分)
13、;(糖胺聚糖结合);(肝素结合);(细胞外基质中具有抗压性的结构成分);(氧化还原酶活性);(胶原蛋白结合);(内肽酶抑制剂活性);(肽酶抑制剂活性);(内肽酶调节器活性);(硫化合物结合);,(补体激活,替代途径);(型糖加工);(铁离子稳态);(体液分泌);(组织分泌);(蛋白质 链接糖基化);(过渡金属离子稳态);(铁离子运输);(骨化调节);(肺发育)。下同。表 差异基因数据分析编码描述基因比背景比率矫正后 基因识别符拷贝数 黏蛋白型 糖生物合成 补体和凝血级联 肾素分泌 信号通路 糖磷脂的生物合成内酯和新内酯系列 金黄色葡萄球菌感染 铁死亡 脂肪酸降解 其他类型 糖生物合成 膦酸盐和
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