SN∕T 1135.3-2016 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 代替 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犘狅 狋 犪 狋 狅犿狅 狆 狋 狅 狆狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言 系列标准共分为 部分： 第部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯病毒检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法； 第部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法； 第 部分：马铃薯病毒检疫鉴定方法； 第 部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法； 第 部分：马铃薯病毒检疫鉴定方法； 第 部分：马铃薯病毒检疫鉴定方法。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。本部分代替 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法 。本部分与 相比，主要技术性差异如下： 删除了“引言” ； 删除了“术语和定义”一章； 增加了“马铃薯帚顶病毒基本信息”一章； 删除了“现场检疫与抽样”一章； 增加了“检测方法”一节； 修改了 检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：李明福、张永江、丁小兰、相宁、李桂芬、魏梅生、陈枝楠、黄文胜、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： 。犛犖犜 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法范围本部分规定了马铃薯帚顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本部分适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯帚顶病毒引起病害的田间调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 植物病毒免疫电镜检测方法 进出境植物及植物产品检疫抽样马铃薯帚顶病毒基本信息中文名：马铃薯帚顶病毒学名：犘狅 狋 犪 狋 狅犿狅 狆 狋 狅 狆狏 犻 狉 狌 狊缩写：分类地位：帚状病毒科（ ）马铃薯帚顶病毒属（犘狅犿狅 狏 犻 狉 狌 狊） 。马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录。方法原理马铃薯帚顶病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。仪器设备、用具及试剂 仪器设备电子分析天平（ ） 、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通仪、电泳系统、计、凝胶成像系统、冰箱、超净工作台、 超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。 用具可调移液器（ 、 、 、 、 、 、 ）及相应的无 吸头、无 离心管、管、研钵、样品袋、标签等。 试剂有特殊说明除外，所有实验用试剂均为分析纯。犛犖犜 三抗体酶联免疫吸附测定试剂（见附录） 、 检测试剂（见附录） 。样品制备抽样按照 的规定进行。将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于 生长并进行症状观察。待长出片片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（ 株为组）并编号。采集的叶片进行三抗体酶联免疫吸附测定、 、免疫电镜检测或生物学测定。检测方法 三抗体酶联免疫吸附测定见附录，其他有效的酶联免疫吸附测定检测方法可参照试剂说明书操作。 犚犜 犘犆犚检测见附录。 免疫电镜检测按照 中的方法进行电镜观察，参照附录病毒粒体形态判定免疫电镜检测结果。 生物学测定见附录。结果判定 、 、 和 中的两种检测结果为阳性，即可判定检出马铃薯帚顶病毒。样品保存与记录结果 样品保存经检验确定携带马铃薯帚顶病毒的样品应在合适的条件下保存，马铃薯病薯块及叶片样品在 或 冰箱中保存，试管苗保存于组培室中，做好标记和登记工作。保存期满后，需经灭活处理。 结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。三抗体酶联免疫吸附测定检测应有酶联板反应的原始数据， 检测应有电泳图片，免疫电镜检测应有病毒粒体照片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。犛犖犜 附录犃（资料性附录）马铃薯帚顶病毒背景资料犃 寄主范围马铃薯（犛 狅 犾 犪 狀 狌犿狋 狌 犫 犲 狉 狅 狊 狌犿）是它唯一重要的自然寄主。在人工接种的情况下还可侵染茄科、藜科的 种植物。犃 分布亚洲：日本、中国台湾、以色列。欧洲：爱尔兰、英国（苏格兰） 、荷兰、芬兰、前捷克斯洛伐克、瑞典、丹麦和挪威。南美洲：玻利维亚、秘鲁、智利。犃 病害症状症状随季节的变化而不同，在马铃薯植株上一般表现为矮化（帚顶） ，叶片有褪绿和坏死的型斑纹，薯块开裂，在较凉的环境下（ ）薯块上有贝壳状的坏死层。图犃 感染犘犕犜犞马铃薯植株犃 传播途径主要靠土壤中的马铃薯粉痂菌犛狆 狅 狀犵 狅 狊 狆 狅 狉 犪狊 狌 犫 狋 犲 狉 狉 犪 狀 犲 犪传播，汁液接种也能传毒。病薯块或组培苗可通过运输远距离传播。犃 粒体形态马铃薯帚顶病毒粒子为直杆状，长度为 、 和 ，宽为 。犛犖犜 图犃 犘犕犜犞病毒粒体犃 基因组特征该病毒的基因组为三组分，正义单链，分别为 ， 和 。犛犖犜 附录犅（规范性附录）三抗体酶联免疫吸附测定（犜犃犛 犈犔 犐 犛犃）犅 试剂犅 包被缓冲液（狆犎 ）碳酸钠（） 碳酸氢钠（） 叠氮化钠（） 用蒸馏水溶解并定容至，储存。犅 犘犅犛犜缓冲液（狆犎 ）氯化钠（ ） 磷酸二氢钾（） 磷酸氢二钠（ ） 氯化钾 用蒸馏水溶解并定容至。犅 样品抽提缓冲液亚硫酸钠（） （ ） 叠氮化钠（） 用缓冲液溶解并定容至，储存。犅 单克隆抗体稀释缓冲液酶标抗体稀释缓冲液小牛血清 犅 底物对硝基苯磷酸二钠（狆）犅 底物缓冲液二乙醇胺 氯化镁（ ） 叠氮化钠（） 溶于 蒸馏水中，用 调至 ，再加蒸馏水到，贮存。犛犖犜 犅 实验步骤犅 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中， 孔，加盖， 孵育，清空孔中溶液，洗涤次，每次 。犅 样品制备待测样品按 （）加入样品抽提缓冲液，用研钵研磨成浆， 犵离心 ，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行，空白对照为样品抽提缓冲液。犅 加样根据检测需要设计 孔（或 孔）酶联板，包括个阴性对照孔、个阳性对照孔、个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为 孔，每个样品设一个重复。冰箱孵育过夜，酶联板用洗涤次。犅 加单克隆抗体洗板，步骤同 ；用稀释缓冲液按说明将单克隆抗体稀释到工作浓度，并加入到酶联板中， 孔，加盖，在 下孵育，清空孔中溶液，洗涤次，每次 。犅 加碱性磷酸酯酶标记的抗体用稀释缓冲液将标有碱性磷酸酯酶的兔抗鼠 按说明稀释到工作浓度，每孔加 ，同步骤 包好，在 下孵育，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤次，洗涤次，每次 。犅 加底物将底物狆加入到底物缓冲液使终浓度为（现配现用） ，按 孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。犅 读数用酶标仪在 、和于 处读值。注：实际检测时，孵育温度、洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。犅 结果判定犅 对照孔的 值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的 值小于 ，当阴性对照孔的 值小于 时，按 计算；阳性对照 值阴性对照 值大于；同一样品的重复性一致。犅 在满足了 质量要求后，结果原则上可判断如下：样品 阴性对照 ，判为阳性；样品 阴性对照值接近阈值，判为可疑样品，需重新做一次，或者用其他方法进行验证；样品 阴性对照 ，判为阴性。犅 若满足不了 质量要求，则不能进行结果判断。犛犖犜 附录犆（规范性附录）犚犜 犘犆犚检测犆 试剂犆 犜犃犈电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷（ ） 冰乙酸 加蒸馏水水至。用时加蒸馏水稀释至。犆 加样缓冲液 溴酚蓝 （质量浓度）蔗糖水溶液犆 引物上游引物 ： 下游引物 ： 。预计扩增片段长度为 。犆 实验步骤犆 核酸提取称取 植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 离心管中，加入 ，剧烈震荡混匀；， 离心 ，取上清液移入新的离心管中，除去不溶成分；在室温下，静置 后加入 三氯甲烷，剧烈振荡 ，在室温下放置 ； 离心 ，取上清液水相放入新的离心管中；加入与上清液水相等体积异丙醇，颠倒混匀，在 下，放置 以上；， 离心 ，在侧壁或管底沉淀；弃上清液，加入 的冷乙醇， 离心 ，弃乙醇，重复次；沉淀放于超净台无菌风吹干 ，干燥后加入 的 ，溶解沉淀，缓慢摇匀后，置于 保存备用。注：或者按照等效提取试剂盒进行操作。犆 犚犜 犘犆犚扩增 的合成：在 管中，加入总，下游引物（ ） ， ， ， ， ，冰上放置 ，加入 ，反转录酶（ ） ， ?酶抑制剂（ ） ， 水浴，合成。扩增：在 管中，加入 缓冲液， ， 上、下游引物（ ） ， 聚合酶（） ，用无菌水补足到 。犛犖犜 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件： ， ； ， ， ， ， ， ， ； ， 。犆 琼脂糖凝胶电泳用电泳缓冲液配制 的琼脂糖凝胶，将扩增产物与加样缓冲液混合，然后将其和分子量标记物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。犆 结果判定犆 阳性对照在 处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。犆 结果达到质控要求，且样品在 处无扩增条带，判定结果为阴性。犛犖犜 附录犇（规范性附录）生物学测定犇 接种病叶加（质量体积）的磷酸盐缓冲液（ ， ）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面，自来水冲洗叶表。做好标签，置于隔离温室中。每天观察记载寄主反应。犇 鉴别寄主症状 德伯纳依烟（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪犱 犲 犫 狀 犲 狔 犻） ：接种叶表现为坏死斑，坏死或褪绿环斑。第一片系统侵染的叶片表现为坏死或褪绿栎叶纹。 苋色藜（犆犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌犿犪犿犪 狉 犪 狀 狋 犻 犮 狅 犾 狅 狉） ：在 下，接种一周或一周以上，接种叶出现坏死环斑，单个的坏死斑可以发展到覆盖半个叶片，没有系统侵染。 珊西烟（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪狋 犪 犫 犪 犮 狌犿 犡犪 狀 狋 犺 犻狀 犮）或三生烟（犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪狋 犪 犫 犪 犮 狌犿 ） ：在低于 情况下，接种叶出现坏死或褪绿环斑，但在较高温度下通常不显症。冬季系统侵染占优势，造成坏死或褪绿栎叶纹。犛犖犜