HPLC-UV法同时测定胡萝卜中5种有机酸的含量.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN185/分析检测AnalysisandTestingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.15.046HPLC-UV 法同时测定胡萝卜中 5 种有机酸的含量Simultaneous Determination of 5 Organic Acid in Carrot by HPLC-UV 吕文超，周春红，沈莹萍，杨 阳，段筱筠，令宾强，马芮萍（甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃 兰州 730050)L Wenchao,ZHOU Chunhong,SHEN Yingping,YANG Yang,DUAN Xiaoyun,LING Binqiang,MA Ruiping(Gansu Province Product Quality Supervision and Inspection Research Institute,Lanzhou 730050,China)摘 要：本研究建立了高效液相色谱-紫外检测器同时测定胡萝卜中5种有机酸的方法，其在各自的范围内线性关系良好，检出限范围为 0.015 8 0.060 7 gkg-1，定量限范围为 0.052 6 0.202 4 gkg-1，回收率范围为 85%115%，RSD范围为0.46%3.20%。胡萝卜样品中均含有5种有机酸，该方法的准确性较好，可用于胡萝卜中有机酸的测定。关键词：高效液相色谱-紫外检测器；胡萝卜；有机酸Abstract：In this study,high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detector method was established for the simultaneous determination of five organic acids in carrot.The linear relationships were good in their respective ranges.The detection limits ranged from 0.015 8 gkg-1 to 0.060 7 gkg-1,The limits of quantification ranged from 0.052 6 gkg-1 to 0.202 4 gkg-1,the recovery rates ranged from 85%to 115%,RSD ranged from 0.46%to 3.20%.Carrot samples all contain five organic acids,the method is accurate and can be used for the determination of organic acids in carrot.Keywords：high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detector;carrot;organic acid中图分类号：TS207.3胡萝卜（Daucus carota var.sativa Hoffm.），属伞形科胡萝卜属胡萝卜种的一年生或二年生双子叶草本植物，亦称红萝卜、金笋或甘荀，在全球范围内种植面积很广。胡萝卜属于根菜类蔬菜，生熟皆可食用，含有多种维生素、氨基酸、微量元素等，其性平、味甘，具有保护呼吸道等的上皮细胞组织的功能，降低慢性疾病的发生率和增强人体免疫力，预防肺癌、强心、降压等功效，因此也称胡萝卜为“土人参”1-3。有机酸是植物的重要组成成分，常用的检测方法有离子色谱法4-5、气相色谱法6、毛细管电泳法7、液相色谱法8等。气相色谱法上机分析测试前需要进行衍生化处理，操作烦琐，重现性较差；毛细管电泳法速度较快、成本低，但相比于液相色谱法，精密度和灵敏度较差9-10。液相色谱法由于操作简单、准确度高、精密度好而广泛应用于食品中有机酸的测定。目前对胡萝卜的研究主要集中在不同工艺、不同种植方式对胡萝卜品质的影响方面，而对其有机酸的含量的研究较少。本研究旨在建立胡萝卜中 5 种有机酸的液相色谱检测方法，为加强胡萝卜的质控及后续的产业化发展提供数据支持。基金项目：甘肃省市场监督管理局重点研发项目（SSCJG-SP-202102）。作者简介：吕文超（1994），女，本科，助理工程师，研究方向为色谱技术。通信作者：周春红（1965），女，硕士，正高级工程师，研究方向为食品及食品相关产品监测。E-mail：。现代食品XIANDAISHIPIN186/分析检测Analysis and Testing1 材料与方法1.1 仪器与试剂U3000 高效液相色谱仪及二极管阵列检测器，赛默飞世尔公司；C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），北京迪马科技有限公司；TLE204E 分析天平（精密度为 0.000 1 g），梅特勒公司；MS3D 涡旋振荡器，IKA 公司；KQ-600DE 台式数控超声清洗器，科桥超声波设备有限公司。酒石酸（CAS：133-37-9）、苹果酸（CAS：6915-15-7）、乳酸（CAS：50-21-5）、柠檬酸（CAS：77-92-9）、丁二酸（CAS：110-15-6）标准品，酒石酸、苹果酸纯度均 99%，柠檬酸、乳酸、丁二酸浓度为100 gmL-1，购于天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、甲酸均为色谱纯，sigma 公司；其他试剂均为色谱纯。1.2 试验方法1.2.1 标准溶液配制标准储备液（100 gmL-1）：准确称取 10 mg 标准 品，加入甲醇使其溶解并用甲醇定容至 10 mL。混合标准溶液的配制（10 gmL-1）：将标准储备液逐级稀释至 10 gmL-1。1.2.2 样品前处理参考马芮萍等11的方法，根据实验要求略有修改：称取粉碎试样 2.0 g（精确至 0.000 1 g）置于 50 mL 离心管中，加入20 mL 70%乙醇水溶液，充分匀浆1 min，40 超 声 提 取 30 min，4 000 rmin-1离 心 5 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中，在残渣中加入20 mL 70%乙醇水溶液复提一次，合并上清液，用 70%乙醇水溶液定容后过 0.22 m 滤膜，待上 HPLC 测定。1.2.3 仪器条件色谱条件。色谱柱：C18（250 mm4.6 mm，5 m）；柱温：25；流速 1.0 mLmin-1；进样量 10 L，检测波长 210 nm；流动相：甲醇-0.1%甲酸水。1.2.4方法学验证参考傅志丰等10的方法，从线性关系、检出限、定量限、精密度、回收率等方面验证方法的可行性。（1）线性关系、相关系数及检出限。将 1.2.1 配制好的系列标准工作液按照色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）做标准曲线，得到 5 种有机酸的线性方程、相关系数。以信噪比（S/N）约为 3、信噪比（S/N）约为 10 得到各成分的检出限（LOD）、定量限（LOQ）。（2）精密度和加标回收实验。精密称取胡萝卜样品 1 共 6 份，加入适量混合标准溶液，采用 1.2.2 进行处理，按照色谱条件进样测定，计算添加水平的加标回收率和相对标准偏差（n=6）。2 结果与分析2.1 5 种有机酸检测方法的建立将一定浓度的 5 种有机酸的混合标准物质溶液在波长 190 400 nm 的波段下进行紫外扫描，结果如图 1 所示。由图 1 可知，酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸在 210 nm 附近均有较大吸收，结合参考文献及国家标准选择 5 种有机酸的检测波长为 210 nm。依据色谱条件进行实验，采用 HPLC 法得到的 5 种有机酸混合标准物质的色谱图如图 2 所示。由图 2可知，5 种有机酸在 10 min 内具有较好的分离度。（a）酒石酸 （b）苹果酸现代食品XIANDAISHIPIN187/分析检测AnalysisandTesting2.2 方法学考查2.2.1 线性关系考查将系列标准物质依次进样，以峰面积为纵坐标，以待测物浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，5 种有机酸的线性关系见表 1。由表 1 可知，在 10 200 ngmL-1，5种有机酸的响应线性关系良好，相关系数均0.999 12，检出限（S/N=3）在 0.015 8 0.060 7 gkg-1，定量限（S/N=10）在 0.052 6 0.202 4 gkg-1。（c）丁二酸 （d）乳酸 （e）柠檬酸图 1 5 种有机酸在 190 400 nm 波段的扫描图图 2 5 种有机酸标准物质的 HPLC 图表 1 5 种有机酸的线性关系考察表有机酸线性范围/（ngmL-1）线性方程相关系数LOD/（gkg-1）LOQ/（gkg-1）酒石酸10 200y=22.193 7x+0.014 80.999 980.015 80.052 6苹果酸10 200y=11.335 7x+0.007 70.999 730.030 50.101 8乳酸10 200y=6.942 7x+0.005 40.999 650.060 70.202 4柠檬酸10 200y=15.026 7x-0.003 40.999 750.039 20.130 5丁二酸10 200y=17.503 9x+0.026 30.999 120.046 00.153 4现代食品XIANDAISHIPIN188/分析检测Analysis and Testing2.2.2 回收率和精密度在胡萝卜样品 1 中添加有机酸标准溶液，加标水平做 6 次平行实验，回收率及精密度结果见表 2。由表 2 可知，5 种有机酸的回收率范围为 85%115%，RSD 范围为 0.46%3.20%。方法的准确性较好，可用于蔬菜中有机酸的测定。2.3 样品含量测定采用建立的方法分别测定了胡萝卜样品 6 份，结果如表 3 所示。由表 3 可知，6 份胡萝卜样品中均含有 5 种有机酸，酒石酸含量在 0.020 5 0.405 0 gkg-1，苹 果 酸 含 量 在 0.009 3 2.265 9 gkg-1，乳 酸 含 量在 0.034 1 2.493 9 gkg-1，柠檬酸含量在 0.012 5 2.901 1 gkg-1，丁二酸含量在 0.062 1 1.214 8 gkg-1。该方法可准确地测定胡萝卜中的酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸。表 2 5 种有机酸的加标回收率和相对标准偏差表（n=6）有机酸加标量/（gmL-1）检测浓度/（gmL-1）加标后浓度/（gmL-1）回收率/%RSD/%酒石酸1.00.1621.3141150.46苹果酸1.00.2071.096890.56乳酸1.010.02710.882850.90柠檬酸1.01.3872.287903.20丁二酸1.00.7471.658910.94 表 3 胡萝卜中 5 种有机酸的含量表 单位：gkg-1有机酸样品 1样品 2样品 3样品 4样品 5样品 6酒石酸0.020 50.021 00.029 10.166 30.323 00.405 0苹果酸0.026 10.009 30.093 81.124 92.265 92.084 4乳酸1.253 40.034 11.015 42.493 90.238 31.643 9柠檬酸0.176 30.012 50.119 62.901 11.852 02.449 1丁二酸0.094 10.062 10.139 50.823 30.536 91.214 83 结论本研究建立了 HPLC-UV 法同时测定胡萝卜中 5 种有机酸的方法，其在 10 200 ngmL-1，相关系数 r2均 0.999，线性关系良好，检出限在 0.015 8 0.060 7 gkg-1，定量限在 0.052 6 0.202 4 gkg-1，回收率范围为85%115%，RSD范围为0.46%3.20%。该方法的准确性较好，操作较简单，可用于胡萝卜中5 种有机酸的测定。参考文献1 张宇光，李甜，孙胜.不同胡萝卜品系品质性状分析 J.山西农业科学，2021，49（2）：141-145.2 冯海萍，金志芸.宁夏南部山区夏播胡萝卜品种筛选及综合评价 J.中国瓜菜，2022，35（10）：69-75.3 桑维峻，张晶，武喆，等.不同土质及株距对鲜食胡萝卜农艺性状的影响 J.山西农业科学，2022，50（2）：179-185.4 李华雨，李晓瑜，刘宁，等.在线固相萃取-离子色谱法测定再造烟叶浆料中的 17 种有机酸 J.烟草科技，2022，55（10）：44-52.5 夏雪琴，罗钰颖，吕尚，等.离子色谱法同时测定乌梅中 4 种有机酸的含量 J.江西中医药大学学报，2022，34（3）：68-72.6DARKO E，THURBIDE K B.Active control of selectivity in organic acid analysis by gas chromatographyJ.Anal China Acta，2020，1106：216-223.7 桑大席，张孔海.加压毛细管电色谱法分析调味果蔬汁饮品中 5 种有机酸 J.食品研究与开发，2020，41（18）：177-182.8 王珍珍，沙如意，王高坚，等.HPLC 法同时测定食用植物酵素中 12 种有机酸 J.食品工业科技，2020，41（19）：279-285.9 穆瑛琦，吴奕萱，王逍，等.离子色谱-串联质谱法检测酒类产品中 10 种有机酸 J.色谱，2022，40（12）：1128-1135.10 傅志丰，周鹤，石燕，等.HPLC 法同时测定甘薯叶中 5 种酚酸和异槲皮苷 J.食品工业科技，2023，44（5）：292-298.11 马芮萍，苏阿龙，朱艳.基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法的花椒中氨基酸和核苷类成分分析与评价 J.中国调味品，2023，48（4）：187-193.