8种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究.pdf

粮食s饲料工业2023,No.5CEREAL&FEEDINDUSTRYdoi:10.7633/j.issn.1003-6202.2023.05.0118种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究饲料资源开发及利用47张红艳，韩姗姗，冉塗侨，胡云红，殷红,张强1（1.陕西省生物农业研究所，陕西西安7 10 0 43;2.陕西省酶工程技术研究中心，陕西西安7 10 0 43）摘要：选用牛津杯琼脂扩散法对自配8 种复方中药液HLJDS、Y Q H、BT WS、WWX D Y、Y JL、Q WT、SBZ、PH-BQC进行同等浓度0.5g/mL下的抑菌活性测定。结果表明：8 种复方药液对产气英膜梭菌均表现极敏或高敏的抑菌活性，抑菌直径范围为17 32 mm;HLJDS、WWX D Y、BT WS、SBZ、Q WT、PH BQ C 对金黄色葡萄球菌表现出中敏以上的抑菌活性,抑菌直径范围为112 2.3 mm;HLJDS对绿脓杆菌试验菌株有一定的抑菌作用，抑菌直径为12.0 mm;HLJDS、Q WT 对沙门氏菌试验菌株有中敏的抑菌活性，抑菌直径分别为12.6 和12.0 mm。从抑菌广谱性来说，HLJDS的抑菌效果最好，其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气英膜梭菌均有抑菌活性；其次QWT对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和产气英膜梭菌也有抑菌活性。关键词：中药；畜禽；致病菌；抑菌活性中图分类号：S816.7Study on bacteriostatic activity of eight kinds of compound Chinese medicinal liquid to common pathogenicbacteria of livestock and poultryZHANG Hong-yan,HAN Shan-shan,RAN Gan-qiao,HU Yun-hong,YIN Hong”,ZHANG Qiang(1.Bio-Agriculture Institute of Shaanxi Xian,710043,China;2.Shanxi Enzyme Engineering Technology Research Center Xian Shaanxi,710043,China)ABSTRACT:The bacteriostatic activity of eight kinds of self-made Chinese herbal medicines(HLJDS,YQH,BTWS,WWXDY,YJL,QWT,SBZ,PHBQC)was determined by Oxford Cup agar diffusion method at the same concentration of o.5 g/mL.Theresults showed that all the eight compounds exhibited very sensitive or highly sensitive antibacterial activity against Bacillusperfringens,with antibacterial diameters ranging from 17 mm to 32 mm.HLJDS,WWXDY,BTWS,SBZ,QWT and PHBQCshowed more than moderately sensitive antibacterial activity against Staphylococcus aureus,with antibacterial diameters rangingfrom ll to 22.3 mm.HLJDS had a certain antibacterial effect on Pseudomonas aeruginosa strains,and the antibacterial diameterwas 12.0 mm.HLJDS and QWT showed moderately sensitive antibacterial activity against Salmonella strains with antibacterialdiameters of 12.6 mm and 12.0 mm,respectively.In terms of the broad spectrum of bacteriostasis,HLJDS has the best bacteri-ostasis effect against Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Salmonella and Perfringens.Secondly,QWT also has an-tibacterial activity against Staphylococcus aureus,Salmonella and Perfringens.KEYWORDS:traditional Chinese medicine;livestock and poultry;pathogenic bacteria;bacteriostatic activity随着养殖业规模化、产业化的发展，我国畜禽养殖行业存在着疫病频发、滥用抗生素、养殖环境日趋恶化等诸多问题。我国农业农村部第194号公告明确要求，退出除中药外所有促生长类药物饲料添加剂品种。随着饲料禁抗令的正式出台，以替代抗生素为核心优势与特点，如中草药、生物发酵饲料、益收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 2；修回日期：2 0 2 3-0 4-0 2基金项目：陕西省重点研发计划项目（2 0 2 2 NY-103）；西安市科技计划农业技术攻关项目（2 3NYGG0034）；陕西省科学院科学研究专项(2021k-11)。作者简介：张红艳（197 8-），女，硕士，助理研究员，研究方向为生物农业。通讯作者：张强（197 4-），男，副研究员，硕士，研究方向为生物农业。文献标志码：A文章编号10 0 36 2 0 2(2 0 2 3)0 50 0 47 0 5生菌、酶制剂、酸化剂、植物提取物等一大批绿色、健康、安全的无抗饲料添加剂产品受到业界的高度关注。天然植物中草药具有来源广泛、价格低廉、毒副作用小、无抗药性等优势，可在饲料中长期添加使用。我国饲料原料目录收录的中草药包括黄柏、48黄芩、苦参、金银花、连翘、板蓝根、鱼腥草、紫苏、蒲公英、柴胡、白芷等清热解毒、抗菌消炎类中药，也包括黄芪、山药、当归、杜仲、甘草、白术、党参、仙茅等补虚扶正、调节阴阳类中药，此外还有神曲、麦芽、谷芽、山楂、大蒜等理气消食、健脾益胃类中药。中草药富含的黄酮、多糖、苷类、生物碱以及挥发油等活性成分，具有抑菌杀菌、提高畜禽机体免疫力和抗氧化能力，且毒副作用小,在防治动物疾病方面具有十分理想的作用，在一定程度上能代替抗生素的使用。李秀富等L1I探究了复方中药(CCM)对肉仔鸡免疫性能的影响，结果表明：日粮中添加复方中药(CCM)能提高肉鸡的免疫器官指数和新城疫抗体效价，且添加1%CCM的试验组效果最优。刘玉华等2 选用6 种中药对鸡白痢沙门氏菌进行体外抑菌实验，结果发现：鸡白痫沙门氏菌对黄芩、连翘、黄连3种药物高度敏感,对夏枯草中度敏感。曹春雷等31研究发现复方中药提取物能显著提高凌云乌鸡的产蛋性能。夏军4研究发现饲喂添加6 0 g/L的复方中药制剂人工乳可治疗猪流行性腹泻。矫松君等5 研究表明，发酵富锗中药对育肥猪的日粮养分消化率、生长性能和屠宰率均有显著提高。隋鹏飞6 1观察和研究了中药代替抗生素治疗猪气喘病的作用,结果显示采用复合中药治疗的病猪病情控制效果要优于对照组，恢复速度快且精神状态也较好。中药提取物是目前国际天然医药保健品市场上一种新的产品形态，是采用先进的工艺技术对中药材或中药复方进行提取分离加工得到的一种药效相对明确的中药产品。大量研究表明,中药提取物有效成分有生物碱、多糖、黄酮、皂、挥发油和有机酸等，添加在饲料中无毒、无公害、无残留，大多还能促进动物免疫功能提高，表现良好的防病促生长性能，可成为抗生素或激素的替代品7。中药提取物有着严格的质量标准，又因其抗菌抗病毒作用强大、易控制、无毒副作用，日益被畜禽养殖领域高度重视。本研究采用中药提取物组配制成的复方中药液对畜禽常见致病菌：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、产气荚膜梭菌进行抑菌研究，对比其抑菌敏感性，为下一步开发畜禽专用无抗生物饲料提供研究基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1中药提取物黄连提取物、薄荷提取物、桔梗提取物、黄芩提张红艳等：8 种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究/2 0 2 3年第5期取物、蒲公英提取物、金银花提取物、黄柏提取物、子提取物、连翘提取物、荆芥提取物、半夏提取物、甘草提取物、当归提取物、杜仲提取物、茯苓提取物、怀牛膝提取物、白头翁提取物、秦皮提取物、野菊花提取物、黄芪提取物、党参提取物（10：1）、鱼腥草提取物、板蓝根提取物、大蒜提取物、五倍子提取物、大青叶提取物、杏仁提取物,均为10：1比例提取物，由西安天叶植物原料技术有限公司提供。1.1.2畜禽4种致病菌金黄色葡萄球菌CMCC(B）2 6 0 0 3、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）CMCC（B）10 10 4、沙门氏菌CMCC（B）50 0 94、产气荚膜梭菌ATCC13124，由广州市微生物研究所有限公司保藏提供。1.1.3培养基营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂培养基、强化梭菌琼脂培养基,购自青岛海博生物科技有限公司。1.2实验方法1.2.1复方中药液的制备按药方比例分别称取8 种复方的中药提取物，充分混合后，按1：2（W/W)加人纯净水浸泡混匀，超声震荡2 0 30 min后，4静置过夜。次日取出超声震荡10 min后放人45保温1h，7 0 0 0 r/m in离心8 min，取上清液备用。1.2.2菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌4种致病菌培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度为110%910 CFU/mL的试验菌悬液。随后将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的新鲜培养物接种至营养琼脂培养基上，37 培养18 2 4h后做活菌计数；将产气荚膜梭菌的新鲜培养物接种至强化梭菌琼脂培养基上，37 厌氧培养18 2 4h后做活菌计数。1.2.3中药液抑菌效果测定采用牛津杯琼脂扩散法测定中药液的抑菌效果。取2 0 mL温度不超过45的琼脂培养基，注人直径90 mm的无菌培养皿中,凝固,制成平板，作为底层。分别接种0.1mL菌悬液至10 0 mL温度不超过45的琼脂培养基中,摇匀,制成接种菌培养基。在每一底层培养基中加入5mL接种菌培养基，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，制成接种菌培养基平板。用镊子将无菌牛津杯均匀地放人接种菌培养基平板上，每块平板等距离放入4只牛津杯。往其中3只牛津杯中分别注人0.2 5mL液体张红艳等：8 种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究/2 0 2 3年第5期样品，同时往第4只牛津杯中注入0.2 5mL液体培养基作为空白对照。操作完毕后，将接种金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的平板平放于37 的恒温培养箱中培养18 2 4h,将接种产气荚膜梭菌的平板平放于37 的恒温培养箱中厌氧培养18 2 4h。培养结束后，测量各个抑菌圈的直径。2结果与分析2.18种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌结果对比实验中药复方依据中兽药古方、化裁已有成方，由若干种中药提取物组配而成,HLJDS、Y Q H、BT-WS、WWX D Y、Y JL、Q WT、SBZ、PH BQ C主要成分详见表1。表18 种中药复方的提取物成分中药复方主要成分HLJDS黄连、黄芩、黄柏、子YQH金银花、连翘、荆芥、薄荷、桔梗BTWS黄连、白头翁、黄柏、秦皮WWXDY金银花、野菊花、蒲公英、连翘、甘草YJL党参、黄芪、茯苓、杜仲、当归、怀牛膝QWT黄芩、桔梗、半夏、甘草、金银花、连翘、板蓝根、鱼腥草SBZ大蒜、五倍子、大青叶、杏仁PHBQC蒲公英、金银花、板蓝根、黄芩、甘草表2 不同复方中药液对畜禽四种致病菌的抑菌结果菌悬液浓度/CFUmL-1金黄色葡萄球菌绿脓杆菌中药复方CMCC(B)260039.0X108杯1+HLJDS杯2杯3杯1YQH杯2杯3杯1BTWS杯2杯3杯1WWXDY杯2杯3杯1YJL杯2杯3杯1QWT杯2杯3杯1SBZ杯2杯3杯1PHBQC杯2杯349按照1.2.1节的方法制备得到生药浓度为0.5g/mL的8 种复方中药液，对比药液在同一浓度下对畜禽常见致病菌：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌结果，详见表2。抑菌结果判定方法按中药药理学中的标准判定，抑菌直径达到2 0 mm及以上的为极敏记为“+十+”;15 19mm为高敏，记为“+十+”；1014mm为中敏，记为“十+”；10 mm及以下为低敏，记为“十”，“二”表示无抑菌作用。由表2 可知,8 种复方中药液对4种致病菌试验株呈现出不同的抑菌效果。中药液对金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的抑菌作用要明显优于绿脓杆菌和沙门氏菌。可以看出，HLJDS、Y Q H、BT WS、WWXDY、Q WT、SBZ、PH BQ C 药液对产气荚膜梭菌试验菌株表现出极敏的抑菌活性，YJL药液对产气荚膜梭菌抑菌活性为高敏;HLJDS药液对金黄色葡萄球菌抑菌活性为极敏，YJL药液对金黄色葡萄球菌试验菌株无抑菌活性，其余6 种均对金黄色葡萄球菌表现出中敏抑菌活性;HLJDS对绿脓杆菌试验菌株有一定的抑菌作用，其余7 种药液均无抑制作用；除了 HLJDS、Q WT 对沙门氏菌试验菌株有中敏的抑菌活性之外，其余6 种均无抑制作用。沙门氏菌产气莱膜梭菌CMCC(B)10104CMCC(B)500946.4X1087.0X108杯1+杯2+杯3一杯1一杯2一杯3+杯1+杯2+杯3+杯1+杯2+杯3一杯1一杯2杯3+杯1+杯2+杯3+杯1+杯2+杯3+杯1+杯2+杯3ATCC131241.7X108杯1+杯2+杯3一杯1一杯2一杯3杯1杯2杯3杯1一杯2一杯3一杯1一杯2杯3杯1杯2一杯3一杯1一杯2一杯3一杯1一杯2杯3杯1+杯2+杯3杯1一杯2一杯3一杯1杯2杯3一杯1一杯2一杯3一杯1一杯2杯3+杯1+杯2+杯3一杯1一杯2一杯3一杯1一杯2杯3+50从结果上来看，对试验菌株有广泛抑菌作用的是HLJDS,其对 4 种致病菌均有较好的抑菌效果，其次是QWT，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气张红艳等：8 种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究/2 0 2 3年第5期荚膜梭菌有一定的抑菌作用。HLJDS、Q WT 平板抑菌圈具体如图1和图2 所示。产气荚膜梭菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌产气荚膜梭菌绿脓杆菌图1HLJDS中药液的平板抑菌圈2.28种复方中药液对单一致病菌的抑菌作用分析金黄色葡萄球菌作为革兰阳性菌的代表，它可引起动物的皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎等疾病，且易传染，治愈率低，给畜禽养殖造成极大的经济损失8 。绿脓杆菌，也称铜绿假单胞杆菌，是一种条件性致病菌，常分布于潮湿环境中，也可存在于人和动物的皮肤、呼吸道和肠道等部位，是引起创伤感染最常见的病原，现已有能引起羊化脓性肺炎、鸡急性败血死亡等的报道,严重危害养殖35上30F25F2015沙门氏菌绿脓杆菌图2 QWT中药液的平板抑菌圈场经济效益。沙门氏菌是人兽共患病原菌，是一种常寄居于人类和动物肠道中的革兰氏阴性胞内兼性厌氧菌,它不仅能够引起畜禽的各种疾病，还能够通过污染的畜禽产品，威胁人类健康10 。产气荚膜梭菌是一种广泛存在于动物肠道中的革兰氏阳性菌,易引起畜禽坏死性肠炎。当畜禽受到外源性产气荚膜梭菌感染后，产气荚膜梭菌能在肠道快速繁殖，导致组织肿胀坏死,并产生大量可致畜禽死亡的外毒素1。8 种复方中药液对4 种致病菌的抑菌效果详见图3。沙门氏菌1050HLJDSYQH金黄色葡萄球菌图3不同复方中药液对畜禽主要致病菌的抑菌作用BTWSWWXDY复方中药液绿脓杆菌沙门氏菌YJLQWT产气荚膜梭菌SBZPHBQC张红艳等：8 种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究/2 0 2 3年第5期实验所选致病菌：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌是畜禽养殖上危害较大的致病菌。由图3可以看出，8 种中药液对产气荚膜梭菌的抑菌作用大小依次为：HLJDSBTWSWWX-DY=SBZ=PHBQCYQH=QWTYJL,抑菌直径范围为 17 32 mm，均达到高敏以上，其中HLJDS抑菌效果最好，YJL抑菌作用略弱；对金黄色葡萄球菌的抑菌结果为：YQH和YJL没有呈现出抑菌效果，其余6 种中药液的抑菌作用大小顺序依次为：HLJDSWWXDYBTWS=SBZQWT PHBQC，H LJD S 抑菌直径为极敏22.3mm，抑菌略弱的PHBQC直径为中敏11.0mm。除此之外,对绿脓杆菌有一定抑菌效果仅有 HLJDS,抑菌直径为 12.0 mm,对沙门氏菌有一定抑菌效果的是QWT和 HLJDS,抑菌直径分别为12.6 mm和 12.0 mm。分析HLJDS的广谱抗菌性跟其主要成分黄芩、黄连、黄柏有关。黄芩、黄连、黄柏是中医临床常用的清热解毒燥湿药，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。三者常相互配合，以提高清热解毒的力度，因此被称为三黄。而QWT中的鱼腥草、黄芩、金银花、连翘、板蓝根、甘草具有清热解毒、疏散风热作用，常用作抗病毒、抗炎药物。组方抑菌效果跟提取物的质量、复合比例以及制剂形态也有一定的关系，下一步还将开展中药复方对畜禽常见病毒（鸡新城疫、禽流感、猪腹泻病毒)的抗病毒研究。3结论中草药是一个健康绿色食品、安全可靠、无环境污染的饲料生产营养添加剂，已被人们广泛地关注与研究,在兽医学中具有极高的应用价值和广阔的应用前景12 。金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌为畜禽养殖常见致病菌，研究中药提取物构成的中药复方对致病菌的体外抑菌活性具有重要意义。结果显示，8 种复方药液对产气荚膜梭菌均表现极敏或高敏的抑菌活性，抑菌直径范围为1732 mm；H LJD S、WWX D Y、BT WS、SBZ、QWT、PH BQ S对金黄色葡萄球菌表现出中敏以上的抑菌活性，抑菌直径范围为112 2.3mm；HLJDS对绿脓杆菌试验菌株有一定的抑菌作用，抑51菌直径为12.0 mm;HLJDS、Q WT 对沙门氏菌试验菌株有中敏的抑菌活性,抑菌直径分别为12.6 mm和 12.0 mm。从抑菌广谱性来说,HLJDS的抑菌效果最好，其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌均有抑菌活性;其次QWT对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌也有抑菌活性。中国国家饲料研究所在2 1世纪中国饲料工业可持续发展与饲料工业科技及中国饲料工业协会在加入WTO对我国饲料工业的影响及对策中均指出，中国应该大力发展以中药提取物为原料的饲料添加剂、预混料、保健品等。在下一步饲用抗生素替代品的研发中，可根据畜禽具体致病菌来选择需要的中药或者中药提取物复方与益生菌、酶制剂共同研发畜禽无抗饲料添加剂产品。参考文献1李秀富，张羽芳，刘娟娟，等.复方中药对肉仔鸡免疫性能的影响研究J.云南畜牧兽医，2 0 2 2（3）：18-19.2刘玉华，林建鹏，刘滨华.泰州地区鸡白痢血清学调查及中药体外抑菌效果研究J.畜牧兽医科技信息，2 0 2 2（4）：36-38.3曹春雷，韦兰和，陈世锋，等.复方中药提取物对凌云乌鸡产蛋性能的影响J.饲料博览，2 0 2 2（1）：33-35.4夏军，中药复方对猪流行性腹泻的治疗试验J.中兽医学杂志2 0 2 2(4)：3-5.5矫松君，杨濛，吕彦彤，等.发酵富锗中药对育肥猪养分消化率、生长性能和屠宰性能的影响J.中国畜牧杂志，2 0 2 1,57(11):205-208.6 隋鹏飞.中药代替抗生素治疗猪气喘病效果观察研究J.中国动物保健，2 0 2 1，2 3（8）：2 1+2 7.7聂丹平，李吉爽.中药提取有效成分在促进畜禽免疫方面的功用JJ.湖北畜牧兽医，2 0 0 3（1）：36-38.8 宁自林，储卫华.畜禽养殖环境金黄色葡萄球菌耐药性及毒力因子分析J.湖北畜牧兽医，2 0 17,38（12）：7-9.9蒋增海，邓同炜，徐耀辉，等.猪源绿脓杆菌的分离鉴定及16SrRNA基因同源性分析J.河南农业科学，2 0 17，46（4）：118-120+133.10于堃，曹中赞，万明，等.噬菌体在防治畜禽沙门氏菌感染中的应用.动物医学进展，2 0 2 1，42（4）：115-119.11夏亿，张元可，徐晶云，等.发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能和肠道健康的影响.中国畜牧兽医，2 0 1946（10）：2 92 7-2 936.12李红霞，刘媛，杨倩，等.无抗养殖背景下中药复方在生猪养殖过程中应用的可行性探讨J.今日畜牧兽医，2 0 2 2,38(4):67-69.（责任编辑：刘斌嘉）