DB15∕T 3359-2024 绵羊体外胚胎生产技术规程(内蒙古自治区).pdf

ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 33592024 绵羊体外胚胎生产技术规程 Technical code on in vitro embryo production in sheep 2024-02-23 发布 2024-03-23 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 33592024 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古赛诺种羊科技有限公司。本文件主要起草人：张家新、陈大勇、程磊、张楠、仇春娟、宋宇琨、范利宏、包梅荣、龚璐、朱怡静。DB15/T 33592024 1 绵羊体外胚胎生产技术规程 1 范围 本文件规定了绵羊体外胚胎生产过程中的卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养等内容。本文件适用于绵羊体外胚胎生产程序。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。体外成熟 in vitro maturation（IVM）卵母细胞在体外恢复减数分裂并发育到第二次减数分裂中期（MII）这一过程，经历细胞核成熟和细胞质成熟。体外受精 in vitro fertilization（IVF）哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。体外培养 in vitro culture（IVC）将受精卵置于适宜的培养条件下使其发育至囊胚期。4 体外胚胎生产培养液配制 采卵液、体外成熟培养液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎发育液（IVC液）配方见附录A。5 操作前准备 DB15/T 33592024 2 打开实验室和超净工作台紫外灯，照射 20 min 后用酒精擦拭消毒；关闭实验室紫外灯 30 min后，操作人员将双手清洗干净后，穿戴工作服、口罩、手套、帽子等，更换拖鞋进入实验室，并随手关闭实验室门；用 75%酒精喷洒消毒双手；实验室工作台、显微镜以及加热台面用酒精擦拭消毒，并且将加热台打开预热。6 卵母细胞体外成熟 准备工作 6.1.1 拣卵针 用酒精灯将采卵用玻璃管拉制成口径适宜的捡卵针，管口在火焰上烧圆钝。6.1.2 制作成熟液滴 实验开始前使用 35 mm 培养皿制作卵母细胞成熟液滴（100 L 成熟液滴，覆盖 3.5 mL 矿物油），并放入 5%二氧化碳培养箱内平衡 2 h 以上。检卵 采卵液于 37 恒温板上提前预热。将含有卵母细胞的采卵液置入 60 mm 的培养皿。在体式显微镜下从左到右、从上到下的顺序仔细挑选，将捡出的卵母细胞放置于盛有采卵液的 35 mm 培养皿中，用成熟液洗涤 3 次。7 体外成熟 将洗涤好的卵母细胞按 15 枚/100 L20 枚/100 L 液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧化碳培养箱培养 22 h24 h。培养条件：5%CO2、95%空气、38.6、饱和湿度。8 卵母细胞体外受精 准备工作 体外受精实验开始前，在 5%二氧化碳培养箱内，平衡受精液（IVF 液）2 h3 h；38.6 预热0.2%的透明质酸酶工作液。体外受精 8.2.1 精液选择 选择体外受精效果好的精液，并根据体外成熟卵母细胞的数量计算所需的精液量。8.2.2 精液解冻 如使用冷冻精液，将所需精液置于 37 40 水浴解冻。8.2.3 精液检查 取约 3 L 精液置于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下检查精子活力和密度。DB15/T 33592024 3 8.2.4 精子上游 将试管架置于 37 加热台上，移液枪吸取约 100 L 精液，缓慢注入装有 500 L 受精液的试管底部，后置于 38.6、5%CO2培养箱内上游 30 min。卵母细胞处理 将体外成熟培养 22 h24 h 的卵母细胞取出，观察卵母细胞成熟情况，记录卵丘细胞扩展情况；用移卵针将全部卵母细胞移入预热的 0.2%透明质酸酶液滴中，轻吹直至剩余 23 层卵丘细胞，使用受精液洗涤 3 次。将洗涤后的卵母细胞按 50 枚/500 L60 枚/500 L 受精液（四孔板）或 15 枚/100 20 枚/100 L 受精液的密度移入受精液中。体外受精 将上游 30 min 后的精液从培养箱中取出，用移液枪沿试管壁从每管上游液中吸取 200 L300 L 上清液加入提前预热好的离心管中，1500 r/min 离心 4 min 后弃掉上清液，剩余约 30 L50 L精子沉淀液，轻轻混匀。用移液枪吸取精子沉淀液，倾斜枪头从边缘插入受精液滴或孔，对准卵母细胞后吹出精液，精液浓度调整至 1106个/mL1107个/mL，后置于 38.6 、5%CO2培养箱内孵育 20 h。9 体外培养 预先将绵羊胚胎体外发育液（IVC 液）在 38.6、5%CO2 培养箱中平衡 2 h 以上。将体外受精20 h 后的胚胎取出置于 IVC 液内，移液枪轻吹以去除黏附的精子及全部卵丘细胞，使用 IVC 液洗涤 3次并对受精卵进行选择（淘汰胞质不均匀、胞质发黑及死卵），之后按 50 枚/500 L60 枚/500 L IVC 液（四孔板）或 15 枚/100 L20 枚/100 L IVC 液的密度移入 IVC 液中培养。培养条件为：90%N2、5%O2、5%CO2、38.6、饱和湿度。胚胎发育鉴定 受精后第 48 h 统计卵裂率（卵裂的个数/总卵母细胞数）；受精后第 168 h 统计囊胚率（囊胚的个数/卵裂的个数）。发育至囊胚阶段的胚胎用于冷冻保存或胚胎移植。10 记录 记录抽卵时间、供体羊耳号、品种、卵泡数、回收卵总数、可用卵数（根据卵丘卵母细胞复合体形态，将其分为A、B、C级）、退化卵数（胞质不均匀、卵丘扩散严重、裸卵数）；记录卵母细胞成熟时间、培养的卵母细胞数量、卵丘扩展情况、卵裂率、囊胚率。DB15/T 33592024 4 A A 附录A （资料性）体外胚胎生产培养液配制 A.1 卵母细胞体外成熟液配制 0.02 IU/mL FSH、0.02 IU/mL LH、1 g/mL E2、0.1 mmol/L半胱胺、10-7 mol/L 褪黑素、10%FBS、0.1 ml青链霉素合剂，使用TCM-199培养基定容至10 mL，混匀后用Millipore 0.22 m的过滤器过滤，在0 5 条件下可保存2周。A.2 采卵液配制 0.05 g BSA、0.035 g肝素钠、0.5 mL青链霉素合剂，使用PBS定容至50 mL，混匀后用Millipore 0.22 m的过滤器过滤，在0 5 条件下可保存2周。A.3 SOF 液配制 3.1452 g NaCl、0.2675 g KCl、0.0814 g KH2PO4、0.0442 g MgSO4、0.2655g丙酮酸钠、1.3115 g CaCl2、0.0251 g肌醇、0.0074 g谷氨酰胺、300 L乳酸钠、0.5 mL青链霉素合剂、1%酚红，使用胚胎水定容至50 mL，混匀后用Millipore 0.22 m的过滤器过滤，在0 5 条件下可保存2周。A.4 受精液(IVF 液)配制 1 mL发情羊血清、6 IU/ml肝素钠,使用SOF液定容至50 mL，混匀后用Millipore 0.22 m的过滤器过滤，在0 5 条件下可保存2周。A.5 胚胎发育液(IVC 液)配制 1 mL 必需氨基酸（50）、0.5 mL 非必需氨基酸（100）、0.15 g BSA，使用 SOF 液定容至 50 mL，混匀后用 Millipore 0.22 m 的过滤器过滤，在 0 5 条件下可保存 2 周。