阈下抑郁动物模型的造模与评价方法研究进展.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 23 期阈下抑郁动物模型的造模与评价方法研究进展申鹏云1，孙小茁2，周胜元21 天津中医药大学研究生院，天津301617；2 天津中医药大学第二附属医院治未病中心摘要：阈下抑郁（SD）是一种是常见心理亚健康状态，又称亚健康抑郁状态，建立一种与人类相似的SD动物模型是防治和了解该病复杂性及相关机制的重要工具。一般来说，SD动物模型是通过一定应激源引起行为情绪变化，诱发脑神经、分子生物学异常来进行构建的，常用的造模方法有不完全性慢性不可预知性温和刺激法、药物诱导法、阈下社会挫败应激法、光周期紊乱法、快速眼动睡眠剥夺法、基因突变法等，通常模型建造是否成功可通过行为学评价（蔗糖偏好实验、悬尾实验、高架十字迷宫实验、明暗箱实验、旷野实验、强迫游泳实验）、体征观察、体质量测定、脏器指数、脑成像等方法进行评判。虽然当前SD动物模型的造模方法与评价方法众多，但缺乏统一标准。因此，研究者应根据实际需求选用合适的造模方法和模型评价方法，以获取最佳的实验结果。关键词：动物模型；心理亚健康；药物诱导法；阈下社会挫败应激法；行为学评价；脏器指数；阈下抑郁doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.029 中图分类号：R749 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）23-0111-04抑郁症（MDD）是一种慢性精神疾病，也是最严重的精神疾病之一，其能够损害人的精神以及躯体功能，已经成为21世纪自杀率上升的重要原因1。阈下抑郁（SD）是处于健康和 MDD 之间的一种状态，指具有某些抑郁的临床症状，但由于病程或者症状不满足MDD诊断标准的一种状态或一类个体2，具体表现为轻度焦虑、精神紧张、情绪失落、兴趣减退、敏感善疑、思维减慢、烦躁失眠等3。根据亚健康的定义，SD属于心理亚健康状态，具有向疾病或健康状态转变的特点4，这一观点也得到了张金鹏等5、有明妍等6研究的支持。相较于健康人群，SD人群更容易发展为MDD。研究发现，许多SD患者在随访中有持续的抑郁症状，1/31/2的患者报告基金项目：天津市教委科研计划项目（2021ZD022）。通信作者：周胜元（E-mail：）开放科学（资源服务）标识码（OSID）21JI Y Y，ZHANG S X，KANG Y，et al.Effects of endogenous dopamine induced by low concentration atropine eye drops on choroidal neovascularization in high myopia mice J.Int J Ophthalmol，2023，16（7）：1034-1040.22MOTZ C T，CHESLER K C，ALLEN R S，et al.Novel detection and restorative levodopa treatment for preclinical diabetic retinopathy J.Diabetes，2020，69（7）：1518-1527.23KIM M K，AUNG M H，MEES L，et al.Dopamine deficiency mediates early rod-driven inner retinal dysfunction in diabetic mice J.Invest Ophthalmol Vis Sci，2018，59（1）：572-581.24CHESLER K，MOTZ C，VO H，et al.Initiation of L-DOPA treatment after detection of diabetes-induced retinal dysfunction reverses retinopathy and provides neuroprotection in ratsJ.Transl Vis Sci Technol，2021，10（4）：8.25LEE Y J，JEON H Y，LEE A J，et al.Dopamine ameliorates hyperglycemic memory-induced microvascular dysfunction in diabetic retinopathy J.FASEB J，2022，36（12）：e22643.26LEE Y J，JUNG S H，KIM S H，et al.Essential role of transglutaminase 2 in vascular endothelial growth factor-induced vascular leakage in the retina of diabetic miceJ.Diabetes，2016，65（8）：2414-2428.27STEINLE J J.Review：role of cAMP signaling in diabetic retinopathy J.Mol Vis，2020，26：355-358.28FIGUEROA A G，BOYD B M，CHRISTENSEN C A，et al.Levodopa positively affects neovascular age-related macular degeneration J.Am J Med，2021，134（1）：122-128.29SHARMA R，GEORGE A，NIMMAGADDA M，et al.Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model J.Nat Commun，2021，12（1）：7293.30STOFKOVA A，ZLOH M，ANDREANSKA D，et al.Depletion of retinal dopaminergic activity in a mouse model of rod dysfunction exacerbates experimental autoimmune uveoretinitis：a role for the gateway reflex J.Int J Mol Sci，2021，23（1）：453.（收稿日期：2023-05-24）111山东医药2023 年第 63 卷第 23 期有中度功能障碍，10%25%的患者会在几年内发展成 MDD。因此，虽然 SD 还未达到 MDD 的程度，但是如果任其发展，将带来严重的后果，是一种不可忽视的疾病7-8。SD动物模型的建立对于探索其发病机制具有重要意义，有助于减少其发病并指导其治疗。但目前医学界对于SD的认知还处于起步阶段，动物实验更少，原有的动物模型也几乎是由MDD 动物模型演化而来，更有部分研究直接照搬MDD动物模型，且关于SD模型的评价方法也缺少统一的标准。本文对SD动物模型的造模方法与评价方法作一综述，为研究者根据实际需求选用合适的造模方法和模型评价方法提供参考。1 SD动物模型的造模方法 SD 属于心理亚健康状态，处于健康与疾病之间。在动物实验中，通常使用小鼠和大鼠模拟SD症状，可以通过测量动物的行为表现、神经递质水平、神经元活动等指标来评估动物是否出现了SD症状，并探讨其可能的治疗方法。由于SD与MDD是平行的两个概念，而二者之间也存在递进关系，所以SD与MDD动物模型的造模方法基本一致，都是通过给予模型动物一定应激源，如孤养、空瓶应激、昼夜颠倒等，模拟人类不健康生活和习惯引起的抑郁情绪等。但是，要使实验动物在研究期间能够维持SD状态，还需要进一步研究验证实验中的应激源刺激量和造模时间9。目前常用的SD造模方法有不完全性慢性不可预知性温和刺激法、药物诱导法、阈下社会挫败应激法、光周期紊乱法、快速眼动睡眠剥夺法、基因突变法等。1.1不完全性慢性不可预知性温和刺激法在使用这个方法造模过程中，动物会接连受到各种不同类型的应激，如冷水浴、电击、不规律饮食和水源、孤养、空瓶刺激、光源紊乱等，而且应激的种类和时间都是无法预测的，该模型可以模拟出长期慢性压力对人们产生的负面影响。一般情况下，MDD动物模型的建立会在28 d内每日施加不规律的刺激，而SD动物模型可以间隔时间给予应激源。孟彦10在建立心理亚健康动物模型时，仅在21 d的应激期里每天给予空瓶刺激10 min，再随机选取其中9 d予以饮食不规律、昼夜紊乱、社会挫败应激；该造模方法与慢性不可预知性温和刺激法的模型建立方法完全相同，只不过是在刺激量以及时间上有所缩短，来模拟人类生活中相对较轻的负面影响而形成的SD状态；经过验证，该法并未造成大鼠明显生理病理改变，仅有轻微焦虑、活动减少等表现，也表明了该方法是可行的。1.2药物诱导法在使用该方法建立的模型中，研究者会使用一些特定的药物及方法诱发抑郁和焦虑等情绪障碍，常用的药物有利血平、激素（去甲肾上腺素、氢化可的松、皮质酮、促肾上腺皮质激素）、五羟色氨、苯丙胺、育亨宾、阿朴吗啡等。其中，利血平诱导法最为常用且成熟，激素诱导仅次于利血平诱导法。使用该方法建立的模型可以帮助研究者更好地理解药物对情绪障碍的影响机制。在MDD动物模型建立过程中，每天需按体质量注射一定量药物，诱导时间为1042 d11。目前还没有研究使用药物来诱导建立SD模型，但冯飞等12研究发现，利血平4 mg/kg是建立MDD模型最为合适的剂量。因此，如果使用该法诱导建立SD模型时可以相对减少药物剂量以及缩短诱导时间。药物诱导的动物模型既可预测抗抑郁药物的治疗效果，还能探索抑郁的潜在机制，操作简便、易行，多用于抗抑郁药物的初筛。1.3阈下社会挫败应激法阈下社会挫败应激法是将实验动物暴露于反复的社交压力下，比如在一个竞争性的社交环境中与强壮的同伴对抗13。这种持续的社交压力会导致实验动物出现多种行为和生理学改变，包括情绪和认知缺陷、代谢障碍、免疫功能受损等。相较于慢性社交挫败应激模型，该方法降低了刺激强度和刺激周期，引起小鼠轻度快感缺乏和不明显的社交回避行为，可以模拟现实生活中同辈压力带来的情绪失落、敏感善疑等SD表现。当前有研究采用该方法建立动物模型用于检测小鼠对应激刺激的敏感性14，尚未应用在SD动物造模中，仍需进一步研究验证。1.4光周期紊乱法光周期是调节动物在24 h内生物节律的重要因素之一，光周期紊乱法是指通过改变光照时间和暗度扰乱其生物节律，从而导致其产生抑郁表现的一种方法。光作为外部刺激，可通过视网膜和松果体传递到大脑中枢神经系统，导致身体产生一系列激素和神经传递物质的变化，并影响到生物钟的节律。动物如果被暴露在相对较长的黑暗时段中，这种环境可以模拟出季节性情感障碍，即冬季抑郁症，主要表现为沮丧、焦虑、厌食、失眠以及焦虑等。根据发病机制可以适度调整光周期来建立SD动物模型，这个模型对于理解动物的行为和代谢适应具有重要意义，也可反映环境因素对生物体生理学调节的重要性15-16。1.5快速眼动睡眠剥夺法在使用这个方法建立模型时，实验动物会被隔离在一个新环境中，并且在睡眠时会受到强制性干扰，如轻微电击等。胡晓辉等17使用小平台水环境法将大鼠放置在高于水面112山东医药2023 年第 63 卷第 23 期1 cm的水槽中，睡眠时肌张力降低的大鼠会落入水中，从而剥夺其睡眠，导致其出现抑郁样行为，且发现剥夺时间与抑郁行为的严重程度呈正相关关系。相关研究表明，睡眠剥夺可对人体产生较大影响，并引起情绪、行为、学习、记忆等方面的失调，表现出与SD相似的症状，而SD患者也常伴随睡眠方面的问题18。该方法简单易行，变量较少、可控，造模时间短，非常适用于SD动物模型的建立。1.6基因突变法一些基因突变可以导致人类出现情绪障碍，比如MDD和双相情感障碍等。因此，研究者会使用转基因技术来建立这类具有基因缺陷的动物模型，以便更好地研究情绪障碍的发病机制。然而，目前发现的遗传基因位点的可重复性和特异性均较差，仍不能精确建立SD动物模型，尚需进一步对SD的遗传机制和遗传位点进行研究，为未来转基因动物模型的建立提供依据19。2 SD动物模型的评价方法 2.1行为学评价常用的行为学评价方法有蔗糖偏好实验、悬尾实验、高架十字迷宫实验、明暗箱实验、旷野实验、强迫游泳实验等，除此之外，还有一些比较少见的评价方法，如休克逃避实验、颅内自刺激实验、新奇抑制摄食实验、洒水实验、水迷宫实验等。这些评价方法的操作虽不一样，但都是为了检测动物快感缺乏、焦虑恐惧、绝望等情绪变化。2.1.1蔗糖偏好实验蔗糖偏好实验能够反映动物的快感缺乏，而快感缺乏是 MDD 的核心评价指标，也能够在一定程度上反映 SD的兴趣减退等症状。既往当大鼠糖水偏爱率30%时，被认为MDD造模成功。张潇等20建立的SD大鼠模型糖水偏爱率约为54.0%，对照组约为78.6%，这表明模型动物还未达到MDD的快感缺乏严重程度，但是存在一定抑郁症状，符合SD的特点。2.1.2悬尾实验悬尾实验能够反映动物的行为绝望状态，通过尾巴固定将小鼠悬挂6 min，记录后4 min小鼠静止不动的时间占比，一般健康小鼠为100 s左右，不动时间越长表明抑郁绝望程度越严重。楚玉玺等21建造的小鼠抑郁模型不动时间为178 s左右。因此，SD动物模型悬尾实验的不动时间应当介于MDD模型和健康对照模型之间。2.1.3高架十字迷宫实验高架十字迷宫实验能够反映动物的焦虑状态，具体操作方法是将动物放置于距离地面一定高度的十字架上，模拟人类在高空时的恐惧、焦虑、不安等心理状态22。十字架一支为有保护区，一支为无保护区，一般记录动物5 min内在保护区和非保护区的时间占比，用于反映模型动物的焦虑严重程度，无保护区停留时间越短提示焦虑程度越严重。有研究总结过往实验中健康对照组无保护区停留时间占比为20%40%，抑郁模型组无保护停留时间占比20%23。建造SD模型后使用高架十字迷宫实验进行评价时，无保护区停留时间占比应为20%左右，且明显高于抑郁组、低于空白组，可以定义为模型建立成功。2.1.4明暗箱实验明暗箱实验是利用动物对明亮地方具有天然的厌恶和好奇倾向而设计出来的，以暗箱中活动时长、穿箱次数、在明暗箱的活动时长以及活动频次等为检测指标，通常高焦虑水平的动物在明箱中活动的时间和频次会明显低于低焦虑水平的动物24。2.1.5旷野实验旷野实验是经典的较常用的情绪相关行为学检测实验，其基于动物对陌生开放场地的摸索好奇以及慌张畏惧情绪，通过记录动物首次进入中央区的潜伏期、中央区停留时间、穿行次数、总运动路程、时间、速度、水平爬格次数、垂直站立次数等指标判断模型动物的抑郁情况25。MDD模型的上述指标均低于健康对照模型。由于当前模型动物种类繁多，实验方法和场地也有差异，因此未能明确指标数值，具体实验中可参考其他评价指标。2.1.6强迫游泳实验强迫游泳实验是将动物放置在狭窄的注水空间中56 min，实验动物最开始会挣扎一段时间，之后会表现出静止不动的行为绝望状态，观察其不动、攀爬和游泳的时间，以此判断实验动物的抑郁程度。正常啮齿类动物的不动时间占检测时间的30%80%，不动时间占比越高提示抑郁程度越严重。然而SD个体在症状上不至于出现绝望或自杀行为，因此 SD 动物模型的强迫游泳实验结果与空白对照比较应无明显差异或差异较小26。2.2体征观察、体质量测定观察动物皮肤毛色、精神行为状态、进食情况、体质量变化等，可以反映动物的抑郁情况。正常动物眼睛明亮、性情温和、鼻唇干净、皮毛光泽、自主活动多、体质量增长正常。受到应激的SD动物模型会表现出不同程度的攻击性、精神萎靡、皮毛光泽度下降、自主活动减少、体质量增长异常等。2.3脏器指数测定脏器指数是将动物处死解剖，称重清洗后的心肝脾肺肾等器官，以此反映动物器官是否有明显病变，判断机体是否发生器质性损伤。SD属于亚健康状态，病理上不会出现明显的脏器肿胀、出血、萎缩等变化。因此，脏器指数某种程度上可以从侧面客观评价模型建立是否合理20。113山东医药2023 年第 63 卷第 23 期2.4脑成像检查SD模型动物也会出现与人类相近的神经影像异常。ACCROMBESSI等27建立了青春期SD动物模型，发现其前额叶皮层、运动和躯体感觉皮层、导水管周围灰色核、红色核、纹状体、伏隔核、海马体、杏仁核、丘脑和小脑均存在不同程度的代谢活动增强，这与人类抑郁患者的脑成像检查变化相似。综上所述，动物模型是开展 SD 动物实验的基础，动物实验能够使我们进一步探究SD的内在发病机制，从而为SD的临床诊断和治疗提供更多参考依据。许多情绪疾病的动物模型造模方法及评价方法已有统一的参考标准和专家共识，然而已有的SD动物造模研究较少，多是将MDD造模方法进行修改，减少其应激源刺激量和刺激时间，从而建立SD动物模型。SD造模的精确应激源刺激量、刺激时间或诱导药物量等均缺乏统一且准确的认识，评价方法也多以MDD动物实验评价指标作为参考，或者以健康对照组和MDD组之间差异具有统计学意义作为造模成功的标志，这样的方法无疑是存在争议的。即便造模成功，SD模型可能向MDD或健康状态转变，如何确保建造的动物模型一直处于SD状态，这也是值得探讨的问题。因此，研究者应根据实际需求选用合适的造模方法和模型评价方法，以寻求最佳的实验结果。参考文献：1LPEZ-BUENO R，CALATAYUD J，ANDERSEN LL，et al.Dose-response association of handgrip strength and risk of depression：a longitudinal study of 115 601 older adults from 24 countries J.Br J Psychiatry，2023，222（3）：135-142.2沈鱼邨.精神病学 .北京：人民卫生出版社，2009：180.3项洁，熊俊，黄守强，等.SD临床研究进展及针灸干预策略探讨 J.中华中医药杂志，2020，35（8）：4027-4029.4胡小勇，杨沈龙，钟琪，等.社会阶层与健康的关系：“社会心理生理”机制 J.科学通报，2019，64（2）：194-205.5张金鹏，有明妍，张怡淳子，等.SD辨识工具及判定标准 J.世界中医药，2019，14（6）：1425-1428.6有明妍，谭曦，张金鹏，等.探讨基于近红外脑成像技术的SD情志刺激反应机制研究可行性 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