DB15∕T 2072-2021 动物垫料中大肠埃希氏菌 0157：H7-NM 检测.pdf

ICS 07.100.01 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20722021 动物垫料中大肠埃希氏菌 O157： H7/NM 检测 Detection of Escherichia coli O157: H7/NM in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 20722021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、二连浩特市疾病预防控制中心、内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：赵治国、崔强、郭文丽、延涵、王海艳、陈林军、敖威华、韩祎陟、靳木子、罗晓平、李军燕。 DB15/T 20722021 1 动物垫料中大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中大肠埃希氏菌O157： H7/NM的定性检测方法、 设备和材料、 培养基和试剂。 本文件适用于动物垫料中大肠埃希氏菌O157：H7/NM定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 设备和材料 4.2 恒温培养箱：36 1 。 4.3 均质器。 4.4 振荡器。 4.5 电子天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 4.6 全自动微生物生化鉴定系统。 4.7 全自动微生物生化鉴定系统。 4.8 酶联免疫分析仪。 4.9 二级生物安全柜。 4.10 pH 计。 4.11 生物显微镜。 DB15/T 20722021 2 4.12 微量移液器。 4.13 无菌锥形瓶：容量 500 mL，250 mL。 4.14 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 4.15 无菌培养皿：15 mm90 mm。 4.16 无菌棉签。 4.17 无菌镊子。 4.18 无菌剪刀。 4.19 无菌勺。 4.20 无菌玻片。 4.21 无菌接种环。 5 培养基和试剂 5.1 实验用水符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 改良 EC 肉汤（mEC+n） ：见附录 A 中 A.2。 5.3 改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC） ：见附录 A 中 A.3。 5.4 三糖铁琼脂（TSI） ：见附录 A 中 A.4。 5.5 营养琼脂：见附录 A 中 A.5。 5.6 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。 5.7 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST） ：见附录 A 中 A.7。 5.8 氧化酶：见附录 A 中 A.8。 5.9 革兰氏染液：见附录 A 中 A.9。 5.10 大肠埃希氏菌 O157 显色培养基。 5.11 大肠埃希氏菌 O157 和 H7 诊断血清。 5.12 生化鉴定试剂盒。 5.13 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 5.14 飞行质谱仪靶板。 5.15 大肠埃希氏菌 O157:H7/NM ATCC 35150 或等效标准菌株。 5.16 EHEC 肠道出血性大肠埃希氏菌 ATCC 35130 或等效菌株。 5.17 大肠埃希氏菌株 ATCC 25922 或等效标准菌株。 6 检验程序 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验流程序见图1。 DB15/T 20722021 3 361，18 h24 h 361，18 h24 h 图1 大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 检验流程 样品制备 检样 25 g 或 25 cm2样液+225 mL mEC+n 肉汤 CT-SMAC 平板和大肠埃希氏菌 O157 显色培养基平板 挑取可疑菌落 510 个接种 TSI，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌 MUG-LST 阴性 阴性 非 E.coil O157 血清学实验 生化实验或辅助鉴定 结果报告 DB15/T 20722021 4 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫料样品，加入225 mL mEC+n肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置361培养18 h24 h，进行预增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复取样14个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2），取样量见表1。取25 mL样品原液加入225 mL mEC+n肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置361培养18 h24 h，进行预增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m2 取样量 cm2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.250.5（含） 50 2 0.50.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 分别用接种环取增菌的mEC+n肉汤增菌液1环，划线接种于一个CT-SMAC平板和一个大肠埃希氏菌O157显色培养基平板，于36 1 培养18 h24 h，观察各个平板上生长的菌落，根据菌落形态初步判定典型和可疑菌落，大肠埃希氏菌O157在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表2。 根据菌落形态挑取510个典型菌落或可疑菌落（少于5个时，全部挑取），划线接种于营养琼脂平板，36 1 培养18 h24 h。 表2 大肠埃希氏菌 O157 在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 大肠埃希氏菌O157菌落形态 CT-SMAC平板 菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色。 大肠埃希氏菌O157显色培养基 依据显色培养基的说明书判定。 DB15/T 20722021 5 7.3 鉴定 7.3.1 革兰氏染色镜检 大肠埃希氏菌O157:H7/NM为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，有鞭毛，动力试验结果呈阳性。其鞭毛抗原丢失，动力试验结果呈阴性。 7.3.2 生化鉴定 挑取纯培养的菌落进行大肠埃希氏菌O157生化鉴定，在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取510个可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌株(ATCC 25922或等效标准菌株)做阳性对照和肠道出血性大肠埃希氏菌（ATCC 35130或等效标准菌株）做阴性对照，于36 1 培养18 h24 h。必要时进行氧化酶试验。 在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察（MUG 阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生，MUG阴性的应无荧光产生），大肠埃希氏菌O157：H7/NM 为MUG 试验阴性，无荧光。 大肠埃希氏菌O157生化试验， 具体依据大肠埃希氏菌O157生化鉴定试剂盒说明书进行， 大肠埃希氏菌O157生化试验结果见附录B。 7.3.3 辅助鉴定 可根据实验室情况， 选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定， 具体操作依据标准GB/T 33682 和设备操作规范进行。 7.3.4 血清学鉴定 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落， 应按照产品说明书用O157和H7诊断血清作玻片凝集试验。 对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次。若动力试验结果为阴性，则确定为无动力菌株。 8 结果报告 综合生化鉴定结果、辅助鉴定结果和血清学试验结果，报告25 g（cm2）动物垫料样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157：H7/NM。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 DB15/T 20722021 6 附录A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 改良 EC 肉汤(mEC+n) A.2.1 成分 胰蛋白胨20.0 g 3号胆盐 1.12g 乳糖 5.0g K2HPO47H2O 4.0 g K2HPO4 1.5 g NaCL 5.0 g 新生霉素钠盐溶液(20mg/mL) 1.0 mL 蒸馏水 1000 Ml A.2.2 制法 除新生霉素外，所有成分溶解在水中，加热煮沸，在2025下调节pH 至6.90.1，分装。于121高压灭菌15min，备用。制备浓度为20mg/mL的新生霉素储备溶液，过滤法除菌。待培养基温度冷至50以下时，按1000mL培养基内加1mL新生霉素储备液，使最终浓度为20mg/L。 A.3 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂 A.3.1 山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂 A.3.1.1 成分 蛋白胨 20.0g 山梨醇 10.0g 3号胆盐 1.5g 氯化钠 5.0g 中性红 0.03g 结晶紫 0.001g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL A.3.1.2 制法 除琼脂、结晶紫和中性红外，所有成分溶解在蒸馏水中，加热煮沸，在20 25 下调节pH 至7.20.2,加入琼脂、结晶紫和中性红,煮沸溶解，分装。于121高压灭菌15min。 A.3.2 亚碲酸钾溶液 A.3.2.1 成分 DB15/T 20722021 7 亚碲酸钾 0.5 g 蒸馏水 200 mL A.3.2.2 制法 将亚碲酸钾溶于水，过滤法除菌。 A.3.3 头孢克肟(Cefixime)溶液 A.3.3.1 成分 头孢克肟 1.0 mg 95%乙醇 200 mL A.3.3.2 制法 将头孢克肟溶解于95%乙醇中，静置1h待其充分溶解后过滤除菌。分装试管，储存于-20，有效期1年。解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存，且在28下有效期14d。 A.3.4 CT-SMAC制法 取1000mL灭菌融化并冷却至461的山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂，加入1mL亚碲酸钾溶液和10mL头孢克肟溶液，使亚碲酸钾浓度达到2.5mg/L，头孢克肟浓度达到0.05mg/L，混匀后倾注平板。 A.4 三糖铁琼脂(TSI) A.4.1 成分 蛋白胨 20.0g 牛肉浸膏 5.0g 乳糖 10.0g 蔗糖 10.0g 葡萄糖 1.0g 硫酸亚铁铵(NH4)2Fe(SO4)26H2O 0.2g 氯化钠 5.0g 硫代硫酸钠 0.2g 酚红0.025g或5.0g/L溶液 5.0mL 琼脂 12.0g 蒸馏水 1000mL A.4.2 制法 除酚红和琼脂外,将其他成分加于400mL蒸馏水中，煮沸溶解，在2025下调节pH至7.40.2。另将琼脂加于600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，加入5%酚红水溶液5mL，混匀，分装小号试管，每管约2mL4mL。于12110min或11515min，制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用，在28条件下可储存一个月。 A.5 营养琼脂 A.5.1 成分 蛋白胨 10.0 g DB15/T 20722021 8 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.2 制法 将各成分溶解于蒸馏水中， 加热煮沸至完全溶解， 调节pH至7.40.2， 分装。 于121 高压灭菌15min。 A.6 半固体琼脂 A.6.1 成分 蛋白胨 1.0g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 琼脂 0.3g0.4g 蒸馏水 100mL A.6.2 制法 将各成分溶解于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.40.2，分装小试管，于121高压灭菌15min，直立凝固备用。 A.7 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-MUG (LST-MUG) A.7.1 成分 胰蛋白胨 20.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g 十二烷基硫酸钠 0.1g 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(MUG) 0.1g 蒸馏水 1000mL A.7.2 制法 将各成分溶解于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，于2025下调节pH至6.80.2，分装到带有倒管的试管中，每管10mL，于121高压灭菌15min。 A.8 氧化酶试剂 A.8.1 蛋白胨水 A.8.1.1 成分 N ，N-二甲基对苯二胺盐酸盐 或N ，N ，N，N-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g 蒸馏水 100mL DB15/T 20722021 9 A.8.1.2 制法 少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7 d内使用。 A.8.2 试验方法 用无菌棉拭子取单个菌落，滴加氧化酶试剂，10 s内呈现粉红或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。 A.9 革兰氏染色液 A.9.1 结晶紫染色液 A.9.1.1 成分 结晶紫 1.0g 95%乙醇 20mL 1%草酸铵水溶液 80mL A.9.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.9.2 革兰氏碘液 A.9.2.1 成分 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300mL A.9.2.2 制法 将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 A.9.3 沙黄复染液 A.9.3.1 成分 沙黄 0.25g 95%乙醇 10mL 蒸馏水 90mL A.9.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.9.4 染色法 A.9.4.1 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min，水洗。 A.9.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗。 A.9.4.3 滴加 95%乙醇脱色约 15s30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.9.4.4 滴加复染液，复染 1min，水洗、待干、镜检。 DB15/T 20722021 10 附录B （规范性） 培养基和试剂 B.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验 自营养琼脂平板上分别挑取2个以上典型菌落或可疑菌落接种三糖铁琼脂，在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，大肠埃希氏菌O157：H7/NM的生化试验结果见表B.1。 表B.1 大肠埃希氏菌 O157：H7/NM 的生化试验结果 生化试验 特征反应 三糖铁琼脂 底层及斜面呈黄色，H2S阴性 山梨醇 阴性或迟缓发酵 靛基质 阳性 甲基红-伏普试验(MR-VP) MR阳性，VP阴性 氧化酶 阴性 西蒙氏柠檬酸盐 阴性 赖氨酸脱羧酶 阳性(紫色) 鸟氨酸脱羧酶 阳性(紫色) 纤维二糖发酵 阴性 棉子糖发酵 阳性 MUG试验 阴性(无荧光) 动力试验 有动力或无动力